DNA第一代,第二代,第三代测序的介绍.doc

双脱氧链终止法又称为 Sanger 法原理是: 核酸模板在 DNA 聚合酶、引物、 4 种单脱氧核苷三磷酸(d NTP ,其中的一种用放射性 P32 标记)存在条件下复制时,在四管反应系统中分别按比例引入 4 种双脱氧核苷三磷酸(dd NTP ), 因为双脱氧核苷没有 3’-OH,所以只要双脱氧核苷掺入链的末端,该链就停止延长,若链端掺入单脱氧核苷,链就可以继续延长。如此每管反应体系中便合成以各自的双脱氧碱基为 3’端的一系列长度不等的核酸片段。反应终止后,分4个泳道进行凝胶电泳,分离长短不一的核酸片段,长度相邻的片段相差一个碱基。经过放射自显影后,根据片段 3’端的双脱氧核苷,便可依次阅读合成片段的碱基排列顺序。 Sanger 法因操作简便,得到广泛的应用。后来在此基础上发展出多种 DNA 测序技术,其中最重要的是荧光自动测序技术。荧光自动测序技术荧光自动测序技术基于 Sanger 原理, 用荧光标记代替同位素标记, 并用成像系统自动检测, 从而大大提高了 D NA 测序的速度和准确性。 20 世纪 80 年代初 Jorgenson 和 Lukacs 提出了毛细管电泳技术(cap ill ary el ect r ophor esis)。 1992 年美国的 Mathie s 实验室首先提出阵列毛细管电泳(cap ill ary array el ectr ophor es is) 新方法, 并采用激光聚焦荧光扫描检测装置, 25 只毛细管并列电泳, 每只毛细管在 h 内可读出 350 bp, DNA 序列, 分析效率可达 6 000 bp/h 。 1995 年 Woolley 研究组用该技术进行测序研究, 使用四色荧光标记法, 每个毛细管长 cM ,在 9min 内可读取 150 个碱基, 准确率约 97%。目前, 应用最广泛的应用生物系统公司( ABI ) 37 30 系列自动测序仪即是基于毛细管电泳和荧光标记技术的 D NA 测序仪。如 ABI3730XL 测序仪拥有 96 道毛细管,4 种双脱氧核苷酸的碱基分别用不同的荧光标记, 在通过毛细管时不同长度的 DNA 片段上的 4 种荧光基团被激光激发, 发出不同颜色的荧光,D 检测系统识别, 并直接翻译成 DNA 序列。杂交测序技术杂交法测序是20世纪80 年代末出现的一种测序方法, 该方法不同于化学降解法和 Sanger 法, 而是利用 DNA 杂交原理, 将一系列已知序列的单链寡核苷酸片段固定在基片上, 把待测的 DN A 样品片段变性后与其杂交, 根据杂交情况排列出样品的序列序检测速度快, 采用标准化的高密度寡核苷酸芯片能够大幅度降低检测的成本,具有部分第二代测序技术的特点。但该方法误差较大, 且不能重复测定焦磷酸测序(pyrosequencing) 技术是近年来发展起来的一种新的 DNA 序列分析技术,它通过核苷酸和模板结合后释放的焦磷酸引发酶级联反应,促使荧光素发光并进行检测。既可进行 DNA 序列分析,又可进行基于序列分析的单核苷酸多态性(SNP) 检测及等位基因频率测定等。 1焦磷酸测序技术的原理及步骤焦磷酸测序是由 DNA 聚合酶(DNA polymerase) 、三磷酸腺苷硫酸化酶(ATP sulfurylase) 、荧光素酶(1ueiferase) 和双磷酸