课题3 血红蛋白的提取和分离.doc

课题 3 血红蛋白的提取和分离一、学****目标:本课题尝试对血液中血红蛋白的提取和分离,使学生能够体验从复杂体系中提取生物大分子的基本过程和方法, 并了解色谱法, 电泳法等分离生物大分子的基本原理,为今后学****运用这些技术打下基础。二、重点:凝胶色谱法的原理和方法三、难点:样品的预处理;色谱柱填料的处理和色谱柱的装填。【基础梳理】一、凝胶色谱法 1 、概念: 也称做;是根据分离蛋白质的有效方法。 2 、原理(1) 由构成的凝胶,内部有许多贯穿的的。⑵当不同的蛋白质通过凝胶时, 相对分子质量的蛋白质容易进入凝胶内部的通道,路程,移动速度,而相对分子质量的蛋白质无法进入凝胶内部的通道,只能在移动,路程,移动速度,从而使不同的蛋白质分子得以分离。二、缓冲溶液 1 、作用: 在一定范围内,抵制的对溶液 pH 的影响,维持 pH 。 2、配制:由种缓冲剂溶解于中配制而成, 通过调节缓冲剂的就可以得到不同 pH 范围内使用的缓冲液。三、电泳 1 、概念: 指在电厂的作用下发生的过程。 2 、原理: 在一定的下, 、等生物大分子的可解离基团会带上或,在的作用下, 这些带电分子会向着与其所带电荷的电极移动。 3 、作用: 电泳利用了待分离样品中各种分子的差异及分子本身的、的不同,使带电分子产生不同的,从而实现样品中的分离。 4、方法: 常用的电泳方法有和。测定蛋白质分子量时通常使用。四、实验操作 1 、样品处理: 通过、、等操作收集血红蛋白溶液。(1) 红细胞的洗涤:目的是。分离时采取,直至上清液中没有,表明红细胞已洗涤干净。(2) 血红蛋白的释放:在和的作用下,红细胞破裂,释放出血红蛋白。(3) 分离血红蛋白溶液:把离心后,将试管中的液体用过滤、除去,于中静置片刻后,分离出下层的。 2 、粗分离: 即透析(1) 方法: 将血红蛋白溶液装入,将放入一定量适宜浓度的中, 透析。(2) 目的:将的杂质除去。(3) 原理:透析袋能使小分子自由进出,而将大分子物质保留在袋内。 3 、纯化: 通过凝胶色谱柱将相对分子质量较大的杂质蛋白除去。操作如下: (1) 凝胶色谱柱的制作。(2) 凝胶色谱柱的装填①材料:本实验使用的是。②方法: 凝胶用充分溶胀后。配成, 一次性倒人色谱柱内。不能有存在;不能发生流干露出凝胶颗粒的现象。(3) 样品的加入和洗脱①a 、准备:加样前,打开流出口,使柱内凝胶面上的缓慢下降到与平齐,关闭出口。 b 、加样:用小心地将 1mL 透析后的样品加到的顶端,注意不要破坏。 c 、加样后:打开下端出口,使样品渗入内。②洗脱:加入,打开下端出口,进行。 4、纯度鉴定: 在鉴定的方法中, 使用最多的是。五、操作提示 1 、红细胞的洗涤: 、与十分重要。过少,无法除去血浆蛋白; 过高和过长会使等一同沉淀,达不到分离效果。 2、色谱柱填料的处理: 商品凝胶使用前需直接放在中膨胀, 可以将加入其中的用加热,加速膨胀。 3 、凝胶色谱柱的装填: 在装填凝胶柱时,不得有气泡存在。气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的,降低。 4 、蛋白质的分离:如果红色区带地移动,说明色谱柱制作成功。【探究归纳】一、人们用鸡的红细胞提取 DNA ,而用人成熟的红细胞提取血红蛋白的原因是什么? 二、洗涤红细胞时为什么不能用蒸馏水代替生理盐水? 三、在血红蛋白释放过程中。加入蒸馏水和甲苯的目的是什么? 四、