考马斯亮蓝法测蛋白质含量.ppt

考马斯亮蓝法测定  ——蛋白质含量
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一、实验目的。
⒈掌握考马斯亮蓝法定量测定蛋白质的原理与方法。
⒉熟练分光光度计的使用和操作方法。
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双缩脲法和Folin—酚试剂法的明显缺点和许多限制，考马斯亮蓝法测定  ——蛋白质含量
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一、实验目的。
⒈掌握考马斯亮蓝法定量测定蛋白质的原理与方法。
⒉熟练分光光度计的使用和操作方法。
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双缩脲法和Folin—酚试剂法的明显缺点和许多限制，促使科学家们去寻找更好的 蛋白质溶液测定的方法。 1976年由Bradford建立的考马斯亮兰法（Bradford法），是根据蛋白质与染料相结合的原理设计的。这种蛋白质测定法具有超过其他几种方法的突出优点，因而正在得到广泛的应用。这一方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定法。
考马斯亮蓝法出现背景
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二、实验原理
★考马斯亮兰G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰的位置，由465nm变为595nm，溶液的颜色也由棕红色变为蓝色。经研究认为，染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合。
★在595nm下测定的吸光度值，与蛋白质浓度成正比
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★实验优点
（1）灵敏度高。据估计比Lowry法约高四倍，蛋白质－染料复合物有更高的消光系数，因而光吸收值随蛋白质浓度的变化比Lowry法要大的多。
（2）测定快速、简便，只需加一种试剂。完成一个样品的测定，只需要5分钟左右。由于染料与蛋白质结合的过程，大约只要2分钟即可完成，其颜色可以在1小时内保持稳定，且在5分钟至20分钟之间，颜色的稳定性最好。因而完全不用像Lowry法那样费时和严格地控制时间。
（3）干扰物质少。如干扰Lowry法的K 、Na 、Mg2 离子、Tris缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、EDTA等均不干扰此测定法。
★实验缺点
（1）Bradford法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差。在制作 标准曲线时通常选用 g—球蛋白为标准蛋白质，以减少这方面的偏差。
（2）标准曲线也有轻微的非线性。因而不能用Beer定律进行计算，而只能用标准曲线来测定未知蛋白质的浓度。
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三、实验器材与试剂
⒈器材。
可见分光光度计、试管、试管架、研钵、离心机、离心管、10ml容量瓶、刻度移液管、移液枪、小麦叶片或绿豆下胚轴。
⒉试剂。
⑴％生理盐水
⑵考马斯亮蓝试剂
称取考马斯亮蓝G250 100㎎，加95％乙醇100ml，溶解后加85％H３ＰＯ４， 100 ml，加水稀释至
1000ml，存于棕色瓶。
⑶蛋白质标准溶液
准确称取经微量凯氏定氮法校正的结晶牛血清清蛋白，配置1000µg/ml标准溶液。
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四、实验步骤
㈠标准曲线的制作
取试管6只，按下表进行编号并加入试剂，充分摇匀。
1
2
3
4
5
6
V（标准蛋白溶液）／µl
0
20
40
60
80
100
V(％生理盐水）／µl
100
80
60
40
20
0
Ρ(蛋白质含量）／（µg／)
0
20
40
60
80
100
试管编号
试剂
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每支试管加入3ml考马斯亮蓝试剂
振荡混合后放置5分钟
于595nm测定吸光度
A595为纵坐标、标准蛋白含量横坐标
绘制标准曲线
㈡样品提取液中蛋白质含量的测定
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取3支试管，各吸蛋白提
，分别加考
马斯亮蓝试剂3ml
振荡混合放置5分钟
以制作标准曲线的1号试管
做空白对照，595nm测吸光度
据所测A595值，于标准曲线
上查出相当标准蛋白的量，取
三重复样品蛋白含量均值
㈢结果计算
样品蛋白质含量=———————— ﹙µg／g鲜重﹚
m为从标准曲线查得的蛋白质含量。
m (µg) ×提取液总体积（ml）
所取提取液体积×样品鲜重（
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㈣、标准比较法
取三只试管，按下表操作
试管编号
试剂
待测管（U)
标准管（S)
对照管（B)
V(样品提取液）／ml

__
__
V（蛋白质标准液)ml
—

V(％生理盐水）／ml
—
__

V（考马斯亮蓝试剂）／㏕


混匀放5min

A595
调零
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★样品蛋白质提取液含量m(µg)=Au／As×100
五、注意事项
⒈待测液中蛋白质浓度不可过高或过低，应控制在100~800µg／ml为宜。
⒉比色测定时，考马斯亮蓝易吸附在比色皿表面，对后续测定造成影响，因此测定结束