重组蛋白质分离纯化.doc

... ... 重组蛋白质的分离纯化摘要: 90 年代以来基因重组技术得到很大的发展,基因工程产品的分离纯化的成本约占其全部成本的 60% ~ 80% ,因此重组蛋白的分离纯化技术越来越重要。本文主要介绍了沉淀、液液萃取、层析等常用分离重组蛋白方法的原理及应用, 旨在为开展蛋白质的制备及其应用研究提供理论依据。关键词:重组蛋白质;分离;纯化;沉淀;液液萃取;层析;包涵体随着基因重组技术的发展, 出现了很多基因工程产品, 而作为基因工程技术的下游工程中的基因重组蛋白的分离纯化技术越来越显示其重要性。据有人统计, 基因工程产品的分离纯化成本约占到其全部成本的 60% ~ 80%[1] 。由此可见产品的分离纯化是获得目的产物的关键一步,也是比较困难的一步,它标志着生物产业的高低。纯化重组蛋白质和普通蛋白质的不同就在于要选择合适的表达系统, 因为表达系统决定了细胞培养过程中产物的性质以及可能产生的杂蛋白, 而纯化重组蛋白质的主要目的是去除杂蛋白质,通常对一种重组蛋白质的纯化会采用多个系统[2] 。但是重组蛋白有几种不同的表达形式, 如细胞外的分泌表达; 细胞内可溶性表达以及包涵体形式的存在, 因此对于重组蛋白的纯化要依据其表达形式的不同,采取不同的纯化工艺。与传统方式相似, 重组蛋白的分离纯化也是利用其物理和化学性质的差异, 即以分子的大小、形状、溶解度、等电点、亲疏水性以及与其它分子的亲和性等性质建立起来的。目前主要的纯化方法有浓缩沉淀法,层析和电泳技术。重组蛋白质在分离纯化的过程中, 必须维持一定的浓度和生物活性形式, 以及防止被降解。因此从生物体中有效分离纯化重组蛋白质一直是个难题。 90 年代以来, 国内外许多科学工作者在蛋白质分离纯化技术和工艺上进行了大量的研制和开发, 将原有的纯化技术水平提高到一个新的高度。本文将简单介绍一些传统的分离纯化方法, 并介绍近 10 年来重组蛋白分离纯化中的新进展和一些新出现的技术。 1 沉淀分离技术 盐析法其原理是蛋白质在高浓度盐溶液中, 随着盐浓度的逐渐增加, 由于蛋白质水化膜被破坏、溶解度下降而从溶液中沉淀出来。各种蛋白质的溶解度不同, 因而可利用不同浓度的盐溶液来沉淀分离各种蛋白质。盐析法的特点是成本低, 不需要特别设备, 操作简单、安全, 对蛋白质的一些生物活性成分破坏较少, 缺点是选择性不强。 有机溶剂沉淀法向蛋白质溶液中加入***或乙醇等水溶性有机溶剂,降低水的活度,随着有机溶剂浓度的增大,水对蛋白质分子表面荷电基团或亲水基团的水化程度降低, 溶液的介电常数下降, 蛋白质分子间的静电引力增大, 从而使蛋白质凝聚和沉淀。其特点是: 选择性高; 其次, 沉淀后所得产品不需脱盐, 残留的沉淀剂通过挥发即可除去。但是有机沉淀剂对具有生物活性的蛋白质、酶类具有失活作用,因而常常需在低温下进行操作。 等电点沉淀法其原理是通过调节溶液的 pH值, 使***电解质在溶液 pH 值处于等电... ... 点时, 分子表面净电为零, 导致赖以稳定的双电层及水化膜的削弱或破坏, 分子间引力增加, ***电解质的溶解度下降,从而沉淀析出。 变性沉淀法利用生物大分子物质对物理、化学等外部环境因子敏感性的差异而选择性地使一种组分发生变性形成沉淀, 而另一些组分保持不变, 从而达到分离、除杂和提纯的目的。此