重组蛋白质分离纯化.pptx

——重组蛋白质的分离纯化
更多更快更纯
2017/10/16
蛋白质结构与功能研究的基本流程
2017/10/16
选择要研究的蛋白
克隆表达目的蛋白
分离纯化重组目的蛋白
测定蛋白溶解性稳定性
大量纯化表达目的蛋白
通过各种结构生物学方法解析目的蛋白结构
核磁
晶体
冷冻电镜
…
蛋白功能研究
结构与功能的关系
药物开发
结构生物学对样品的要求
2017/10/16
蛋白浓度:10-15 mg/ml
蛋白纯度:>95%
蛋白构象均一:单体,二体,多聚体
蛋白具有活性
在结构生物学研究中,重组蛋白表达纯化至关重要!
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纯化策略 ——更多更快更纯
2017/10/16
实验室常用的蛋白质的 纯化方法与检测方法
2017/10/16
检测方法:
A280nm紫外吸收值;
考马斯亮蓝;
SDS-PAGE蛋白凝胶电泳
凝胶过滤疏水层系离子交换亲和层系反相层析
2017/10/16
A280检测原理:蛋白质分子中常含有酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸等苯环结构,在紫外280nm波长处有最大吸收峰,其光吸收值与蛋白质浓度成正比,故可以用280nm波长吸收值大小来测定蛋白质含量
考马斯亮蓝检测原理:每个分子含有两个SO3H 基团,偏酸性,与蛋白质的碱性基团结合。
考马斯亮蓝G-250在游离状态下呈红色,最大光吸收在465nm;当它与蛋白质结合后变为青色,蛋白质-色素结合物在595nm波长下有最大光吸收。其光吸收值与蛋白质含量成正比。
考马斯亮蓝R-250与蛋白质反应虽然比较缓慢,但是可以被洗脱下去,所以可以用来对电泳条带染色。
SDS-PAGE原理:聚丙烯酰***凝胶,是由丙烯酰***单体和少量的交联剂N,Nˊ-甲叉双丙烯酰***(Bis)在催化剂(过硫酸***或核黄素)和加速剂(N, N,NˊNˊ-四***乙二***)的作用下聚合交联成的三维网状结构的凝胶。
凝胶对样品分子筛效应:电场中,颗粒小、呈球形的样品分子泳动速度快;颗粒大、形状不规则的分子通过凝胶空洞时受到的阻力大,泳动慢。
不论经过多少步纯化,最后都要根据SDS-PAGE来检测蛋白的纯度!!!
镍柱的原理与发展
Ni柱中的***化镍或者硫酸镍可以与有His(组氨酸)标签的碱性蛋白蛋白结合,组蛋白标签一般是6个组氨酸(碱性氨基酸)。在蛋白上样后,带有组氨酸标签的蛋白特异性结合到柱子里,其他的杂蛋白流出。Ni-NTA纯化介质是Ni离子金属螯合介质。
His-Tag融合蛋白是目前最常见的表达方式,而且很成熟,它的优点是表达方便而且基本不影响蛋白的活性,无论是表达的蛋白是可溶性的或者包涵体都可以用固定金属离子亲和色谱去(IMAC)纯化。
2017/10/16
组氨酸咪唑
富集作用强!
凝胶过滤(分子筛)纯化原理
2017/10/16
离子交换纯化原理
2017/10/16
低盐上样,高盐洗脱
离子交换具有浓缩效应
蛋白质在溶液中有***电离现象。假设某一溶液中含有一种蛋白质。当pI=pH时该蛋白质极性基团解离的正负离子数相等,净电荷为0,此时的该溶液的是pH值是该蛋白质的PI值。某一蛋白质的pI大小是特定的,与该蛋白质结构有关,而与环境pH无关。
在某一pH溶液中当pH>pI时该蛋白质带负电荷。反之pH<pI时该蛋白质带正电荷。pH=pI时该蛋白质不带电荷
蛋白带负电,阴离子交换柱;蛋白带正电,阳离子交换柱
三步纯化步骤的逻辑组合
2017/10/16
净化或充分稀释的样品
亲和层系
↓
凝胶过滤
离子交换
↓
凝胶过滤
亲和层系
离子交换
凝胶过滤
捕获阶段
中度纯化
精细纯化