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植物原生质体相关材料 2013-9-2 From HZB 一、植物材料研究表明,几乎从植物的所有部位都能得到原生质体,其中以叶片为多。根尖组织也是植物原生质体的重要来源,它可由各种植物的种子萌发后取得。花粉经特异酶处理也能得到原生质体,在单倍体遗传育种中有特殊的用途。但是,要获得高质量的原生质体,则须选用生长旺盛、生命力强的组织作材料。材料的生理状况是原生质体质量的决定性因素之一。 1. 细胞悬浮培养物在建立细胞悬浮培养物之前,需提前培养愈伤组织: 取用成熟种子胚、未成熟胚、幼穗、花药、胚芽鞘或幼叶,经无菌消毒后,在 26 ℃黑暗条件下, 在含 2,4 -D 2-4mg/L 的 MS 固体培养基上,诱导愈伤组织,每隔 2-4d 转接一次。从中选出增殖较快而且呈颗粒状的愈伤组织, 或经继代培养一次后, 转移到液体培养基的 100ml 三角瓶中进行悬浮培养。具体方法是用旋转式振荡器,速度控制在 80-120r/min ,在 25 ± 1℃下暗培养。通常经悬浮培养 3~ 4 月后,悬浮培养细胞的大小变得较为一致,且细胞质变得较浓时,可用作分离原生质体。 2. 叶肉细胞叶肉细胞是分离原生质体的最好的细胞材料,用叶片的薄壁组织作为材料来源,既要考虑植株的生长环境,又要考虑叶片的年龄及其生理状态对原生质体分离的影响。取生理状态适宜的叶片,有利于原生质体的细胞再生和细胞分裂。要获得良好的培养材料,下列外界因素是需要着重考虑的: ( 1 )光强为 3000-6000lx 。( 2 )温度为 20-25 ℃培养。(3 )相对湿度在 60 % -80 %左右。植物的其他器官也可用于分离原生质体,如用花粉四分体和花粉壁细胞。 3. 植物材料的预处理对原生质体材料进行预处理能提高原生质体的分裂频率;也可以逐步提高植物材料的渗透压,以适应培养基中的高渗环境。这些处理包括:暗处理、预培养、低温处理等。例如, 把豌豆的枝条取下后, 在分离原生质体前, 先让材料在黑暗中的一定湿度条件下放 1~ 2d , 这样得到的原生质体存活率高,并能继续分裂。在羽衣甘蓝叶肉组织原生质体分离和培养中,先去掉叶片的下表皮, 再在诱导愈伤组织的培养基中预培养 7d , 然后再去壁; 经预培养的叶片分离的原生质体高度液泡化,叶绿体也解体。龙胆试管苗的叶片只有用 4CC 低温处理后分离得到的原生质体才能分裂。但在很多情况下材料不必经过专门的预处理。二、酶 1. 酶的种类构成植物细胞壁的三个主要成分是: ①纤维素,占细胞壁干重的 25 %至 50 %不等; ②半纤维素, 平均约占细胞壁干重的 53 %左右; ③果胶质,一般占细胞壁的 5 %。分离原生质体最常用的酶有纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶。 ZA3-867 纤维酶是上海植物生理研究所从野生型绿色木霉同各菌种中提取制成的,粗制品是多种酶的复合物,含有纤维素酶(包括 C1 、 CX 、B 一葡萄糖苷酶等) 、果胶质、半纤维素酶等,分离细胞壁的效果较好。这种复合酶使用时不需加半纤维素酶和果胶酶等,就可以分离出植物原生质体。日本产的 Onozuka 纤维素酶常和果胶酶结合使用,可先用果胶酶降解果胶,使分开细胞,再用纤维素酶处理降解细胞壁。即二步法降解。 2. 渗透稳定剂植物细胞壁对细胞有良好的保护作用。去除细胞壁之后如果溶液中的渗透压和细胞内的渗透压不同,原生