临检培训基因扩增技术在遗传病基因诊断中的应用临检培训班.pptx

基因扩增技术在遗传病基因诊断中的应用
刘敬忠
首都医科大学附属北京朝阳医院
北京基因诊断实验室
北京朝阳医院法医物证司法鉴定所
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如果引物5’端有几个与模板DNA不配对的碱基，仍可能与模板DNA退火、延伸，对PCR效果影响不大。这一特点，可使PCR产物两端带上限制酶的Linker，或造成DNA顺序的缺失、插入、碱基替代等。大大增大了PCR技术的应用范围。
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影响PCR效果的重要因素及注意事项：
PCR技术的原理似乎非常简单明了，PCR反应的操作也并不复杂；但要取得好的结果和良好的可重复性并非易事。必须彻底弄通其分子生物学的奥妙之处，并把握其各种影响因素，规范操作。以下列出影响PCR扩增效果的主要因素
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引物设计一定要科学合理，序列的特异性要高。
长度一般在18-25个碱基，Tm值可按公式（G+C总数x4）+（A+T总数x2）（℃）估算。
尽可能避开4个以上G或C等相同碱基串联重复。
尽可能避免引物内部形成发夹结构或引物之间形成二聚体（Dimer）的可能性。
G、C与A、T的比例尽可能1:1左右。
同一反应管中的引物（甚至同一个Lab的所有引物）Tm值设计的相同。
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引物在反应体系中的浓度要经过优化。双重PCR及多重PCR对各引物浓度间的比例要求更严。
基因组DNA制备液纯度要好。其用量也并非越多越好。
各种试剂小量分装保存，避免多次冻融。
dNTP浓度要优化。
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退火温度参考Tm值进行优化。其对PCR的成败，非特异产物的出现与否关系最大。
Taq DNA聚合酶的厂牌、批号和用量均要合适。
对扩增难度较大的PCR，Mg2+浓度要适当增加。
操作者的手法也有影响，要在实践中总结提高技术。
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荧光定量PCR行HLA-DrB1位点分型法的建立及与血清学方法的比较
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HLA分型技术
HLA（人类白细胞抗原）
MHC区基因（主要组织相容性复合物基因区）
高度多态性的基因区
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HLA分型技术
一、淋巴细胞微量细胞毒试验
1964年，Paul Terasaki, LA, USA
二、DNA分型法
优点：
1. 血样不要求新鲜;
2. 白血病患者WBC表面抗原被破坏, 只
能用DNA分型法;
3. 结果更准确可靠
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HLA分型技术
DNA-RPLP, 1982
PCR/SSO
PCR/反向斑点杂交
PCR/SSCP
PCR/SSP
PCR/SBT
R-Q-PCR/SSP
PCR/dHPLC等
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在序列特异性引物聚合酶链反应（PCR-SSP）技术基础上，将荧光定量PCR（FQ-PCR）技术与SSP结合起来，建立了自动化程度更高的荧光定量PCR- HLA分型技术，完成了46例尸肾供受者的HLA-DBR1分型。 FQ-PCR不需走电泳，减少了污染的机会，提高了自动化程度。同时又开展了以DNA测序为基础的HLA分型（SBT）技术。
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三、主要方法：
1、HLA血清学分型。
2、常规PCR-SSP反应。
3、SBT分型法： (1)PCR扩增DRB1片段。 (2)用ABI-373型自动测序仪测序。 (3)测序数据分析及分型。
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结果和讨论
一、进行PCR-SSP法HLA-DRB1位点分型：
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4、荧光定量PCR技术原理：
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图3、荧光定量PCR中反应前的模板浓度与Ct值成反比
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图4、15 R-II号样本荧光定量分型结果
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图5、SSP分型结果与上述一致
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FQ-PCR分型的优点：
(1)荧光定量分型法省去了电泳分析、UVP成像的操作，简化步骤，提高自动化程度，减少了工作量。
(2)判读结果与扩增由仪器同时完成，节省了PCR后处理的时间，结果更客观。
(3)将引物的特异性和探针的特异性结合，提高了准确性。
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(4)只需在反应前打开离心管一次，即可