DNA第一代,第二代,第三代测序的介绍.docx

原理是：核酸模板在DNA聚合酶、引物、4种单脱氧核苷三磷酸(dNTP,其中的一种用放射性P32标记)存在条件下复制时，在四管反应系统中分别按比例引入4种双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)，因为双脱氧核苷没有3'-OH,所以只要双脱氧核苷掺入链的个DN***段文库的扩增平行进行。对于每一个片段而言,扩增产生几百
万个相同的拷贝。乳液PCR终止后,扩增的片段仍然结合在磁珠上。
4）测序携带DNA的捕获磁珠被放入PTP板中进行测序。PTP孔的直径（29口m）只能容纳一个磁珠（
20口m）。放置在4个单独的试剂瓶里的4种碱基，依照T、A、C、G的顺序依次循环进入PTP板，每次只进入一个碱基。如果发生碱基配对,就会释放一个焦磷酸。这个焦磷酸在ATP硫酸化酶和荧光素酶的作用下，释放出光信号，并实时地被仪器配置的高灵敏度CCD捕获到。有一个碱基和测序模板进行配对，就会捕获到一分子的光信号；由此一一对应，就可以准确、快速地确定待测模板的碱基序列
与其它第二代测序平台相比,454测序法的突出优势是较长的读长，目前GSFLX测序系统的序列读长已超过400bp。虽然454平台的测序成本比其他新一代测序平台要高很多，但对于那些需要长读长的应用，如从头测序，它仍是最理想的选择。
Solexa测序技术
Illumna公司的新一代测序仪GenomeAnalyzer最早由Solexa公司研发，利用合成测序（SequencingbySynthesis）的原理，实现自动化样本制备及大规模平行测序。GenomeAnalyzer技术的基本原理是将基因组DNA打碎成约100-200个碱基的小片段，在片段的两个末端加上接头（adapter）。将DN***段变成单链后通过接头与芯片表面的引物碱基互补而使一端被固定在芯片上。另外一端随机和附近的另外一个引物互补，也被固定住，形成桥状结构。通过30轮扩增反应，每个单分子被扩增大约1000倍，成为单克隆的DNA簇，随后将DNA簇线性化。在下一步合成反应中，加入改造过的DNA聚合酶和带有4种荧光标记的dNTP。在DNA合成时，每一个核苷酸加到引物末端时都会释放出焦磷酸盐，激发生物发光蛋白发出荧光。用激光扫描反应板表面，在读取每条模板序列第一轮反应所聚合上去的核苷酸种类后，将这些荧光基团化学切割，恢复3'端黏性，随后添加第二个核苷酸。如此重复直到每条模板序列都完全被聚合为双链。这样，统计每轮收集到的荧光信号结果，就可以得知每个模板DN***段的序列GenomeAnalyzer系统需要的样品量低至lOOng，文库构建过程简单，减少了样品分离和制备的时间，配对末端读长可达到2X50bp，每次运行后可获得超过20GB的高质量过滤数据，且运行成本较低，是性价比较高的新一代测序技术。SOLiD测序技术
SOLiD全称为SupportedOligoLigationDetetion，是ABI(应用生物系统)公司于2007年底推出的全新测序技术，目前已发展到SOLiD3Plus。与454和Solexa的合成测序不同，
SOLiD是通过连接反应进行测序的。其基本原理是以四色荧光标记的寡核苷酸进行多次连接合成，取代传统的聚合酶连接反应。具体步骤包括：
文库准备SOLiD系统能支持两种测序模板：片段文库(fragmentlibrary)
或配对末端文库(mate-pa