生物实验室操作规范.docx

Revised by BLUE on the afternoon of December 12,2020.
生物实验室操作规范
生物实验室操作规范
生物实验室规范
进入实验室需要在实验室使用登记簿上登记，没有细检查使用过的仪器、器材，确定离心机电源关闭，水浴锅锅盖改好，显微镜已关闭，最后应清理桌面，保持实验室整洁干净，垃圾桶快满时注意将垃圾带走并换上新的垃圾袋；
酒精喷壶、酒精灯中酒精快用完时，注意及时补充，尤其是酒精灯。
细胞培养
细胞培养注意事项
打开生物安全柜紫外灯消毒30分钟以上，开启安全柜前玻璃面板，至少运行风机10分钟以上，保证气流稳定；
提前将培养液置于37℃水浴锅加热（注意不要被紫外线照射以防破坏营养成分）。若旧培养液耗尽，则应立即在新培养液的容器上标注使用人的姓名；加热时间不宜过长，达到室温即可；
对双手消毒后打开培养箱，将培养瓶瓶盖旋紧后取出样品并放入安全柜，标记传代次数，将加热至室温的培养液取出，并用酒精擦拭消毒（注意不要擦拭有字区域）后放入安全柜。
培养液成分
HL-60细胞所采用的全培养基成分为89%RPMI-1640、10% FBS和1% 双抗（青霉素/链霉素）；
HeLa细胞所采用的全培养基成分为84%DMEM、15% FBS和1% 双抗（青霉素/链霉素）。
细胞复苏
将细胞从液氮中的冻存盒取出，用镊子夹着冻存管置于37℃水浴中，不停晃动冻存管（尽量避免冻存管封口处浸入水中，以防细胞被污染），使其快速完全融化，得到细胞悬浮液；
用移液枪将细胞悬浮液吸出放入离心管中，15ml离心管都行，用15ml多加培养液，可将DMSO去除更干净），加入适量（的培养液并混匀，然后进行离心去除悬浮液中的DMSO，设定离心转速800r/min左右，离心4分钟左右；
弃去离心管中上层含DMSO的冻存液，一般加入新培养基4~5ml（根据培养瓶和或培养皿的容积确定），混匀，然后移入培养容器中。
注意：如果细胞存活率不高，可尝试先加入适量新培养液直接培养，一天后再换新培养液，根据实验结果来看，刚解冻细胞对离心较敏感。
细胞传代
悬浮细胞传代
用5mL移液枪吸走4/5的细胞悬浮液（大约为4ml）；
换新枪头，加入与吸走悬液相同量的新培养液；
用移液枪混匀，放入培养箱；
注意：如果需要精确传代，则需对细胞悬液进行计数，然后保留所需数目的细胞进行培养。
贴壁细胞传代
用旧液体轻轻冲洗培养瓶底，然后用移液器枪吸尽旧培养液（弃去）；
加入2ml左右 PBS，轻轻摇晃，然后同样用移液枪吸掉PBS（用PBS是为清洗掉旧培养液中的血清，因为血清可抑制胰酶的活性，后面也是采用含血清新培养液终止胰酶消化的）；
加入约~1ml胰酶（为常规5ml的培养瓶和5ml培养皿的用量，没有明确限制，只奥胰酶能润湿所有细胞即可），室温或放置4~5分钟，培养箱中放置1~2分钟（放置于显微镜下观察，细胞变圆时就可以终止消化）；
加入约1ml~2ml培养基（含有小牛血清）终止消化；
(a) 如终止消化后，大部分细胞还贴壁，则可直接吸走胰酶和培养液的混合物，然后加入适量新培养液，然后将细胞和培养液混合均匀，取适量到新培养瓶/皿中，继续培养。
(b) 如终止消化后，大部分细胞已脱落到胰酶和培养液的混合液中，则需