SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测鸡PD-1和PD-L1 mRNA方法的建立.pdf

年中国畜牧兽医学会兽医病理学分会
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暨中国病理生理学会动物病理生理学专业委员会学术研讨会论文集
SYBR GreenⅠ荧光定量 PCR 检测鸡 PD⁃1 和
PD⁃L1 mRNA 方法的建立
王选年王爱银梅
, , , , , ,
新乡学院新乡
( , 453003)
摘要:程序性死亡分子及其配体属于抑
1(programmed death⁃1,PD⁃1) (programmed death ligand,PD⁃L)
制性共刺激分子能对免疫反应的产生起负调节作用主要表达于+ + 细胞细胞巨噬
, 。 PD⁃1 CD4 、CD8 T 、B 、
细胞和树突状细胞[1⁃2] 的配体有两种类型分别为和能诱导表达在较多类型
。 PD⁃1 , PD⁃L1 PD⁃L2,PD⁃L1
细胞表面仅表达在较少类型细胞表面[3⁃4] 在肿瘤自身免疫性疾病和感染性疾病中
,PD⁃L2 。、,PD⁃1/ PD⁃L
参与免疫反应的调节抑制抗瘤及抗病毒免疫反应阻断此通路后可以恢复特异性+ 细胞的部分
1 , , CD8 T
功能通路可能与肿瘤细胞免疫逃避和病毒感染疾病慢性化有关[5] 为建立鸡和
。 PD⁃1/ PD⁃L1 。 PD⁃1 PD⁃
实时荧光定量检测方法根据中的基因序列以鸡肌动蛋白
L1 SYBR GreenⅠ PCR , GenBank PD⁃1、PD⁃L1 ,
基因为内参设计特异性引物扩增目的基因片段将三种目的基因克隆至载体上经
(β⁃actin) , 。 pMD18⁃T ,
测序鉴定得到各自阳性克隆质粒以三种阳性克隆质粒为标准品进行倍比稀释以建立标准曲线
, , , 1 ∶ 10 ,
并进行熔解曲线分析以及敏感性特异性重复性试验结果表明当标准品稀释度为 2 10
、、。, 1 × 10 ~ 1 × 10
时三种基因的值与浓度间具有良好的线性关系相关系数 2 均大于敏感性较好熔
copies / μL , Ct , R 0􀆰 990, 。
解曲线分析表明产物为特异性单峰且重复性较好应用建立的方法对只周龄雏鸡外周血单核
, 。 10 4 SPF
细胞和的相对表达量进行检测结果表明虽然鸡中的平均表达
PD⁃1 PD⁃L1 mRNA , , PBMC PD⁃1 mRNA
量约为的平均表达量约为种目的基因都呈低水平表达但其
152copies / μL,PD⁃L1 mRNA 187copies / μL,2 ,
表达水平在本方法检测范围内且重复性良好本研究成功建立了敏感性高特异性强重复性好的鸡
, 。、、
和实时荧光定量检测方法研究结果为鸡和的定量分析提供
PD⁃1 PD⁃L1 SYBR GreenⅠ PCR , PD⁃1 PD⁃L1
了技术平台
。
主要参考文献:
[1] Yamazaki T,Akiba H,Iwai H,et al􀆰 Expression of programmed death 1 ligands by murine T cells and APC [ J]􀆰 J Immunol,2002,169(10):
5538-5545
[2] Ishida M,Iwai