291-国家重点基础研究发展计划.doc

国家重点基础研究发展计划(973 计划) 课题任务书项目名称:生物固氮作用的分子机理研究课题编号: 201 0CB12 6502 课题名称:根瘤菌固氮系统调控的分子机理中华人民共和国科学技术部制 20 10-1 一、研究内容根瘤菌-豆科植物共生固氮作用的研究主要包括两个生理学过程:即:结瘤和固氮。有关早期根瘤的发生、发展和形成过程中微生物与植物相互识别、信号分子间相互作用的研究,近年来取得了突破进展。然而,在共生体形成过程中早、中、晚期根瘤菌与宿主植物相互作用的研究仍缺乏系统性。尽管在根瘤菌、豆科植物都积累了大量的结瘤不固氮( nod +f ix-)的突变体, 但其关键的功能基因及其调控机制都不清楚, 如:豆科植物中根瘤菌共生信号转导机制、根瘤中类菌体分化、固氮和衰老等生理过程有关的功能基因、信号分子、及与宿主相互作用的调控机制等。本课题广泛和深入开展根瘤菌固氮系统调控的分子机理研究,在分子水平上探讨低等微生物与高等植物遗传信息是如何交流的?共生固氮体系是如何建立的? 固氮功能是如何发挥的等关键科学问题,将为提高生物固氮效率、扩大根瘤菌寄主植物范围、为探索建立非豆科植物共生体系提供科学依据。同时, 为共生固氮在农业生产中的应用提供理论基础和技术支撑。主要研究内容如下: 1、苜蓿中华根瘤菌( Si norhi zobiu m mel iloti ) LysR 和 GntR 转录因子家族中共生固氮必需基因的作用及其调节机理: 双组份系统(组氨酸激酶和反应蛋白)调节根瘤菌细胞周期相关基因表达的分子机理。通过基因敲除技术,构建苜蓿中华根瘤菌共生固氮必需的 Ly sR家族转录因子 Ls rA和 Ls rB以及 G ntR 家族转录因子 G trA 和G trB 基因的缺失突变体,考查不同突变体的共生固氮表型;通过基因芯片技术,分离和鉴定出不同转录因子所调控的下游靶基因,研究苜蓿中华根瘤菌双组份调节系统在自生和共生条件下的作用机制和功能,阐明根瘤菌代谢与共生固氮功能的相关性和调控机理,为改造和提高共生固氮效率奠定理论基础。 2、根瘤菌Ⅲ型分泌系统、群体感应系统及胞外多糖合成基因表达调控系统在共生固氮过程中的作用机理: 根瘤菌具有侵染豆科植物形成共生固氮根瘤, 除了产生结瘤因子和植物因素外, 还具备有病源细菌的特性,如分泌特殊蛋白的分泌器-- Ⅲ型分泌系统( T3S S)、群体感应系统、产生丰富的胞外多糖等。本研究以广谱根瘤菌 NGR23 4(Rhi zobiu m sp. NGR2 34) 为材料,鉴定出根瘤菌Ⅲ型效应因子( NopM, y4lO , Nop L, No pP and Nop T)分泌出去的新蛋白,并通过酵母双杂交技术鉴定与根瘤菌Ⅲ型效应因子相互作用的植物靶蛋白,阐明其作用机制。在根瘤菌 NGR2 34中,各种突变体显示聚糖酶 ExoK 通过酶切降解胞外多糖( E PS )从而产生具有共生活性的胞外寡糖( E OS )。 exok 基因的突变使根瘤菌失去了在多种豆科植物上形成固氮根瘤的能力,为了进一步阐明其作用机制,通过 EO S( Exo K) 依赖的根瘤菌 N GR234 与模式植物百脉根的共生,利用蛋白质组学和 DNA 微阵列技术,从百脉根中鉴定出受 EO Ss诱导调控的基因。通过 RNA 干扰技术敲除基因活性可以阐明这些基因在共生过程中的功能。 3、类菌体及其与宿主方控制类菌体分化、固氮、衰老的功能基因组研究: 以模式豆科植物共生固氮体系为材料,利用蛋白质与蛋白质、蛋白质与 DNA 、蛋白质与R NA 的相互作用,建立根瘤菌与宿主植物共生关系建立早期蛋白相互作用网络。分离和鉴定参与根瘤菌结瘤因子信号传递的调控元件及基因,研究植物响应根瘤菌结瘤因子的作用方式、传递途径及其信号蛋白的调控机制。阐明小 G蛋白 Ro p6、 MA PKK 、 S IP1 、 C IP73 等蛋白及转录因子在共生信号接受和传递中的功能和作用机理。分离和鉴定根瘤菌-宿主共生双方控制类菌体分化、根瘤固氮和根瘤衰老的系列功能基因和信号物,阐明 dm tH,op a22, lpsH 基因对华癸中生根瘤菌类菌体分化和根瘤发育的调控作用。通过对豆科植物与根瘤菌、 AM 真菌共生的异同以及与非豆科植物比较基因组学研究,揭示非豆科植物中存在哪些与共生相关基因的功能及调控机制,为探索扩大根瘤菌寄主范围和建立非豆科共生固氮途径可能性提供科学资料。 4、根瘤菌生物多样性及其环境与固氮作用的关系:充分利用我国根瘤菌和豆科植物的资源优势,广泛开展根瘤菌生物多样性的研究。结合我国西部开发,研究抗逆共生固氮体系的分子机理,筛选和构建高效、抗逆共生固氮体系。在理论上阐明根瘤菌自身代谢调控系统(如: 分泌系统( T3SS )、群体感应系统、产生丰富的胞外多糖等)在不同环境条