电转染操作流程.doc

NeonTM电转染一般流程
电穿孔前一至两天，将细胞转移至装有新鲜培养基的培养皿中，保证实验当天细胞量达到70-90%。
加培养基（不含抗生素）到24孔板中，每孔500µl，放于37℃培养箱预热。（注：使用其他孔数培养板或者100µl枪NeonTM电转染一般流程
电穿孔前一至两天，将细胞转移至装有新鲜培养基的培养皿中，保证实验当天细胞量达到70-90%。
加培养基（不含抗生素）到24孔板中，每孔500µl，放于37℃培养箱预热。（注：使用其他孔数培养板或者100µl枪头时，加入培养基和质粒及细胞的数量见下表1）
将培养细胞取出，悬浮细胞直接取部分培养的细胞计数，确定细胞密度；贴壁细胞用2ml的PBS冲洗细胞，吸出PBS，加入约750µl胰酶消化3min，加入750µl培养基，终止消化，取部分细胞悬液进行细胞计数，确定细胞密度。
将悬浮细胞转到离心管，室温下100-400g离心力离心5min，倒掉上清。
向细胞中加入2mlPBS冲洗细胞，室温下100-400g离心力离心5min。
吸出PBS,用重悬缓冲液R重新悬浮细胞沉淀，×107个/ml。轻轻吹打细胞，使其形成单细胞悬液。（注：细胞悬液在室温时间不能超过15-30min,否则将导致细胞活性和转染效率降低）
，再加入细胞悬液，轻轻混匀。所用细胞浓度、DNA和接种体积见下表1）。
将装有3ml电解缓冲液E的NeonTM管插入移液器架中。
在仪器上设置脉冲电压、脉冲宽度、脉冲数。
10．将枪头插入NeonTM移液器中，用10µl的枪头吸细胞混合液，枪头中必须无气泡。将带有样品的NeonTM移液器垂直插入NeonTM管中。
11．选择电穿孔方案，并按下触摸屏上的Start（开始）键。
12．电脉冲释放后，触摸屏上会显示完成，提示电穿孔完成。
13．将脉冲好的样品立即转移至准备好的装有预热培养基的培养板中。将培养板放到培养箱培养。
14．实验结束后，倒掉移液器中E液，关闭电转仪。
注意：1．加R液体积=四大格细胞总数/（4×104）×细胞液体积/（×107）。
2．加入质粒体积=加入质粒的量/质粒浓度。
3．加入细胞悬液体积=需加细胞数量/细胞悬液浓度。
4．每个枪头最多只能用2次。
5．NeonTM管装入的3m