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生物催化工程的第三次浪潮
过去的十年里，由于科技的进步，无论是实验室还是工业规模都已确定用具实用性并且环保的生物催化来代替化学合成中的传统的金属催化和有机催化。
DNA测序以及基因合成的关键进展是基于剪切生物催化剂通过蛋白质工程和设计，了可能带来的第三次浪潮的提示。现今及时评估第三次浪潮的影响及推测未来十年可能的带来什么进展（框1）。尽管生物催化涉及到代谢工程和合成生物学，但这些综述重点是针对酶法和全细胞反应。
框1生物催化应用要求及实例
传统的生物催化，天然产物采用自然反应和途径转变成其他天然产物。技术要求：尽可能控制自然生物转化；实例：面包和奶酪制作，皮革加工，啤酒和酒发酵，及天然抗生素生成。
宽底物范围生物催化，化学中间体（非天然产物）通过自然反应和途径转变成其他化学中间体。技术要求：特定酶的使用（没有干扰活性存在）；概念要求：许多酶具有宽的底物范围；实例：采用酯酶和羰基还原酶（乙醇脱氢酶）生产医药中间体。
多级生物催化，天然产物通过非自然反应和途径转变成燃料，材料和化工原料（非天然产物）。技术要求：蛋白质工程主要用于稳定性，底物范围和催化反应类型的改变；概念要求：酶可以催化非自然反应，酶的新的组合产生新的途径；实例：用异戊二烯生物合成途径生成燃料分子，氨基酸生物合成燃料乙醇。
适应酶工程的制造工艺
为了最大限度降低成本，化工业需要在希望的工艺条件下产生稳定的，选择性的及高产的催化剂。这样的加工的酶设计先要确定设计目标，例如增加稳定性，可选择性，底物范围，或是通常这些性质的结合。2000年，第三大浪潮前，只有很少的策略可以满足这些目标。酶的固定化可以增加蛋白的稳定性，但是稳定性的增加幅度较温和而且往往不能满足大多数化学转化。定向进化也有可能满足这些目标，但仍然缓慢，因为它需要对大型数据库进行建立和筛选，而且这些数据库中大部分突变体是活性降低甚至没有活性的。大幅改进的例子很少与产业相关。低速意味着进化的蛋白仅包含一些变化，因此，酶性质仅稍微得到改变。尽管几百年来酶法工艺已经应用于工业，但大部分设计的酶和全细胞从遗传学上已
被最低限度的改变了。
流程设计标准（-个
或一些或全部）所需性质改变的定
量检测
•生产过程中的高活性
•稳定性增加
•热稳定性的最高温度增肌
•对有机溶剂稳定
•底物缺失和/或产物抑制
•储存和运输热稳定性增加
选择性提高（对应选择性、位置选择性、化学选择性）
•作用新底物
•催化新反应
△G
蛋白质设计目标
对蛋白质力学和动
力学的理解
•未折叠酶不稳定
•折叠酶稳定
•增加底物结合
阻止多余底物
•重塑底物结合位点
•添加主要力学过程
△G
蛋白质设计策略（氨
基酸变化）
结合计算机模型的
结构模型设计
构建空间位阻
•添加氢键和离子对
通过形成环降低或增加柔性（熵）
•疏水相互作用
1
!
蛋白质多样性策略
（氨基酸变化）
更可取的分子但并
非必须
•通过随机突变，定点突变，定点饱和突变，转基因等得到突变体
•接近反应条件的条件下进行检测
•采用生物信息学工具如ProSAR优化确定提高适应性的突变体或是
氨基酸替换
核酸和基因组优化
•提高目的基因转录效率（超表达，高保真）
（沉默突变，非编码
•增加mRNA稳定性
区变化）
•提高mRNA翻译效率
•调整启动子长度
•改进核糖体结合序列
•增加适合有机体酶生成的密码子的使用
•当需要合适的折叠时增加密码子使用以加速或降低翻译
•敲除催化底物或产物副反应的酶的密码子或是讲解目的酶
图2通过蛋白质工程策略结合自由能（辺）设计目标所需的结构改变
这一推理需要利用更集中的数据库。如果设计目标并非在于开始酶的作用，那么大变化的自由能是必要的。对蛋白质伸展及反应机理的力学和动力学的理解确定达到设计目标的设计策略。最终，结构分析（从定性的检测到大量的计算机模拟的差异）可以确定必须改变的区域和氨基酸。需要高的自由能变化的目标将同样需要结构上更广泛的变化。
过去的十年里，我们对蛋白质和有效地定向进化策略属相的理解都加深，可能酶学性质发生巨大改变。总的来说，酶工程仍将是通过运用各种解决目前问题可能的方法，对研究成果进行收集，而不是例如用在那些土木，电器，软件或是化学工程的学科的定量的方法。这些实验研究转化为动力学原理将需要运用自由能与设计目标产物结合成需要的结构变化（图2）。性质的巨大转变需要自由能的较大转变。例如，稳定性的明显改变将需要折叠-伸展平衡时更多的自由能变化。（甚至蛋白质不可逆的伸展起始于一个可逆的部分伸展。）对蛋白质分子生物学的理解暗示着策略可得到改善。例如，表面残基促进折叠-伸展平衡，并且