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生物催化工程的第三次浪潮
过去的十年里,因为科技的进步,不论是实验室还是工业规模都已确立器具
适用性并且环保的生物催化来取代化学合成中的传统的金属催化和有机催化。
DNA测序以及基因合成的要点进展是鉴于剪切生物催化剂经过蛋白质工程和设
计,及将酶整合入新的生物合成门路的能力获得的巨大进步。为了突出这些成就,
在此我们议论了以酶催化作为要点步骤,将蛋白质-动力学生物催化剂应用于从
通用化学品到先进医药中间体的范围。
生物催化是对合成化学中微生物和酶的应用,作为自然界的催化用于新的目
的:酶的应用还未波及到[1-5]。经过几次技术研究创新的浪潮,当前生物催化
领域已达到其公司成熟水平。
图1酶发现的进度及用于确立所需催化剂的蛋白质工程策略
理性设计(b)鉴于蛋白构造(a)或是同源模建辨别不一样的突变位点,而随机突变(c)与
挑选或是选择联合是定向进化实验的基础。联合这些方法使建立更小型但更智能的数据库
(d)成为可能。此刻经过富集培育(e)对酶进行传统挑选已被要点的主题数据库检索(f)
取代以指导新式酶或是他们具备的所需特征确实定。在其早期还是酶的设计(g)的从头计
算(从头合成denovo)。内部构造指的是经过生物催化不一样的浪潮可获取的进行化学物质。
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R)-苯乙醇***(左)在100年前的植物提取物中已经获取;(1S,3S)-3-氨基环己醇(中)由Novartis公司利用一种固定化酯酶制成;6-***-2,4,6-3脱氧-D-赤型六吡喃环(右)由
DSM用一个设计的醛缩酶耐受高浓度乙醛并且获取高选择性的过程制的。
生物催化的第一次浪潮(图1),始于一个多世纪从前,科学家认识到活细
胞的构成成分能够应用于有效地生物转变(相对于几千年已经****以为常的发酵过程)。比如,Rosenthaler利用一栽种物提取物从苯甲醛和***化氢合成的(R)-苯乙醇***[6];发生在微生物细胞内的类固醇的羟化[7]也已知。较新的例子即洗衣粉中蛋白酶的利用[8]。葡萄糖异构酶将葡萄糖转变为更甜味的果糖[9],青霉素G酰基转移酶制备半合成抗体[10]。这些应用要点挑战在于生物催化剂稳固性的
限制及诸这样类的弊端主要经过酶的固定化来战胜,这也有利于酶的重复利用。
生物催化的第二次浪潮,在20世纪80到90年月,最先的蛋白质动力学技术,代表性的即鉴于构造的技术,扩大了酶的底物范围以同意异样的合成中间产物的合成。这一变化将生物催化扩展到医药中间体和精美化学品的制备。实例包含脂肪酶催化水解手性前体用于合成地尔硫卓(一种治疗血压药物),醇***酶催化合成醇类对映异构体应用于降胆固醇克制素药物,脂肪酶催化合成蜡酯类物质比如肉豆蔻醇肉豆蔻酸酯或是十六烷基蓖麻醇酸酯用于化妆品工业,以及***类水合酶催化水合丙烯***形成丙烯酰***用于高分子资料(这种***类水合酶已在紫红红球菌全细胞中获取)。除固定化以外,当前的挑战包含优化用于非天然底物的催化剂。
现阶段,生物催化的第三大浪潮开始于20世纪九十年月中后期PimStemmer
和FrancesArnold的工作。他们开创了分子生物学方法,经过达尔文进化论体外实验快速大量地修饰催化剂。只管这一术语于1972年的全细胞实验中曾被用过,此刻这一方法往常称为定向进化,这一技术的最先方法波及到在一个蛋白质
中氨基酸的随机突变的迭代循环法,随后从酶稳固性提高,底物特异性以及对应
选择性的突变体形成的库中挑选法。议论到此,此后的发展已经集中于提高定向
进化的效率以产生“更智能地”数据库。工业生物催化主要集中于水解酶,一些
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***复原酶(KREDs),以及辅因子重生和在有机溶剂中蛋白质的稳固性研究。在某些状况下,优化代谢门路;比如,交融不一样的自然界菌株的基因于一个新的宿主细胞以产生1,3-丙二醇(形成多聚体的单体),使得将甘油转变为更易被利用的原料葡萄糖成为可能。
因为此刻的生物催化浪潮获得的进展,将酶设计成引人瞩目的新功能,比如接受从前的惰性基质(孟鲁司特的KRED或是西他列汀的转氨酶),或是改变形成产物的性质(萜环化酶突变体可作用于不一样的萜烯或是氨基酸代谢物使醇类作为生物燃料)。此刻需要新式酶将生物量变换为第二或第三代生物燃料,资料和化
学品。第三大浪潮的主要发展是先进的酶工程(包含定向进化),基因合成,序列剖析,生物信息工具和计算机模拟,并且酶改良的理论进展可能比本来预期的要更明显。工程酶能够在含有60uC的有机溶剂的溶液中保持稳固,能够接受新的底物以及催化新的非天然反响。当前这一工程可能需要几个月,这样大大扩展潜伏的应用。过去,设计酶化的过程遇到酶的限制;当前,酶设计渐渐适应工艺规范。
大概十年前,《Nature》和《Science》的文件综述了第一次和第二次生物催化浪潮,提出了可能带来的第三次浪潮的提示。当今实时评估第三次浪潮的影响及推断将来十年可能的带来什么进展(框1)。只管生物催化波及到代谢工程和合成生物学,但这些综述要点是针对酶法和全细胞反响。
框1生物催化应用要求及实例
传统的生物催化,天然产物采纳自然反响和门路转变为其余天然产物。技术要求:
尽可能控制自然生物转变;实例:面包和奶酪制作,皮革加工,啤酒和酒发酵,
及天然抗生素生成。
宽底物范围生物催化,化学中间体(非天然产物)经过自然反响和门路转变为其
他化学中间体。技术要求:特定酶的使用(没有扰乱活性存在);观点要求:许
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多酶拥有宽的底物范围;实例:采纳酯酶和羰基复原酶(乙醇脱氢酶)生产医药
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适应酶工程的制造工艺
为了最大限度降低成本,化工业需要在希望的工艺条件下产生稳固的,选择性的及高产的催化剂。这样的加工的酶设计先要确立设计目标,比如增添稳固性,可选择性,底物范围,或是往常这些性质的联合。2000年,第三大浪潮前,只有极少的策略能够知足这些目标。酶的固定化能够增添蛋白的稳固性,可是稳固性的增添幅度较平和并且常常不可以知足大多半化学转变。定向进化也有可能知足这些目标,但仍旧迟缓,因为它需要对大型数据库进行成立和挑选,并且这些数据库中大多半突变体是活性降低甚至没有活性的。大幅改良的例子极少与家产有关。低速意味着进化的蛋白仅包含一些变化,所以,酶性质仅略微获取改变。尽
管几百年来酶法工艺已经应用于工业,但大多半设计的酶和全细胞从遗传学上已被最低限度的改变了。
流程设计标准(一个
生产过程中的高活性
或一些或所有)
稳固性增添
所需性质改变的定
热稳固性的最高温度增肌
量检测
对有机溶剂稳固
底物缺失和/或产物克制
储藏和运输热稳固性增添
选择性提高(对应选择性、地点选择性、化学选择性)
作用新底物
催化新反响
G
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蛋白质设计目标
对蛋白质力学和动
力学的理解
蛋白质设计谋略(氨
基酸变化)
结共计算机模型的
构造模型设计
蛋白质多样性策略
(氨基酸变化)
更可取的分子但并
非一定
核酸和基因组优化
(缄默突变,非编码
区变化)

未折叠酶不稳固
折叠酶稳固
增添底物联合
阻挡剩余底物
重塑底物联合位点
增添主要力学过程
G
建立空间位阻
增添氢键和离子对
经过形成环降低或增添柔性(熵)
疏水互相作用
经过随机突变,定点突变,定点饱和突变,转基因等获取突变体
靠近反响条件的条件下进行检测
采纳生物信息学工具如ProSAR优化确立提高适应性的突变体或是
氨基酸代替
提高目的基因转录效率(超表达,高保真)
增添mRNA稳固性
提高mRNA翻译效率
调整启动子长度
改良核糖体联合序列
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增添适合有机体酶生成的密码子的使用
当需要适合的折叠时增添密码子使用以加快或降低翻译
敲除催化底物或产物副反响的酶的密码子或是解说目的酶
图2经过蛋白质工程策略联合自由能(△G)设计目标所需的构造改变
这一推理需要利用更集中的数据库。假如设计目标并不是在于开始酶的作用,那么大变化的自
由能是必需的。对蛋白质伸展及反响机理的力学和动力学的理解确立达到设计目标的设计谋
略。最后,构造剖析(从定性的检测到大量的计算机模拟的差别)能够确立一定改变的地区
和氨基酸。需要高的自由能变化的目标将相同需要构造上更宽泛的变化。
过去的十年里,我们对蛋白质和有效地定向进化策略属相的理解都加深,可能酶学性质发生巨大改变。总的来说,酶工程仍将是经过运用各样解决当前问题可能的方法,对研究成就进行采集,而不是比如用在那些土木,电器,软件或是化学工程的学科的定量的方法。这些实验研究转变为动力学原理将需要运用自由
能与设计目标产物联合成需要的构造变化(图2)。性质的巨大转变需要自由能的较大转变。比如,稳固性的显然改变将需要折叠-伸展均衡时更多的自由能变化。(甚至蛋白质不行逆的伸展开端于一个可逆的部分伸展。)对蛋白质分子生物学的理解示意着策略可获取改良。比如,表面残基促使折叠-伸展均衡,并且在环区增添一个脯氨酸会降低伸展形式的熵。这些策略取代了随机突变(大多半拥有更差的性质)巨大的数据库,而是包含高比率拥有活性且潜伏的改良的突变体
构成的更小的,更集中的蛋白质数据库(图1)。最后,经过估量各样反响(表面离子对或是增添脯氨酸对熵变的贡献)的强度,研究者能够估量出达到目标所需的变化。当前极罕有研究人员明确的应用鉴于自由能的方法来计算蛋白质自由能策略,可是将实验研究转变入动力学原理需要一种定量的方法。新的改良的方法
过去的十年里,DNA技术和生物信息学主要进展已经为生物催化领域供给了要点性的支持。这些工具已经促使了自然资源中新式酶的发现,并且大概上加快
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了当前生物催化剂的从头设计。
先进的DNA技术
新一代的DNA测序技术已能够大规模且相当低成当地进行平行序列的剖析。
但是,2002年人类基因组序列剖析的成本预计为70,000,000美元,2012年景本
已大大降低了
1,000倍,低于
10,000美元(参照
34),LifeTechnologies
公
司,Illumina
公司和OxfordNanoporeTechnologies
公司已宣告能够在几个小
时内对人类全基因组达成测序的测序设施的设计经在
2012年晚些推出,这将使
每一个基因组的成本降低起码于
1,000美元。不一样环境的有机体的全基因组序
列,或是环境中的不行培育的有机体(宏基因组)的
DNA样本,都已成立了丰富
的资源,以供在此中搜寻新式生物催化剂[35],并且会连续进行。运用Illumina技术进行大规模的高通量测序(10,000,000序列读取)也促使了对蛋白质序列-功能关系的探究和认识[36]。
低成本DNA合成已取代基因组DNA的分别成为蛋白质工程的初步。全基因DNA合成能够进一步为宿主生物体优化密码子,将分子整体构造比如启动子,停止子,增强子,限制性位点等引入到适合的位点。DNA合成应用传统的亚磷酰***化学法,可是优化的反响条件已经提高了配对效率,这样增添了聚合物整体质量和数目使得序列能够甚至达到200-250个核苷酸长度。并行DNA合成应用光刻和喷墨印刷技术进一步降低成本并实现快速合成[37]。DNA合成也已被用于染色体DNA的整个部分甚至用于代谢门路工程的全基因组的合成[38]。全基因合成也可被用于合成高质量DNA数据库,范围从小型,集中,饱和位点数据库到大型,综合性的基因库。自定义的基因甚至基因库正成为近似此刻研究实验室使用的试剂
和溶剂的商业化化学品。
生物信息学新式工具
对实验进展进行增补,生物信息学工具已经成为现代蛋白质工程的一个主要
部分[39]。大的酶家族和同源性搜寻的多序列比对中已经确立拥有相像催化活性
的基因,致使新式的,强有力的生物催化剂[40]。相同的序列信息能够重修原始
的生物催化剂[40],它可能拥有更宽泛的底物范围和催化多功能性(见下文)。
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多序列比对确立每个位点最常有的氨基酸(共有序列)和氨基酸代替以获取功能稳固的酶。这一数占有助于拥有高比率催化活性突变体的小型数据库的设计。这些数据库已被用于稳固性、催化功能增强及立体选择性改变的生物催化剂的发现
。
联合鉴于序列的蛋白质工程的进展,构造指导的方法已经从储藏在RCSB蛋
白数据库()中蛋白质构造坐标快速增添中获益。过去的十年里,资源库增添已超出450%,包含超出77,000种蛋白构造。这既有利于合理蛋白质的设计又促使定向进化,因为有关蛋白的构造比对有助于确立明显地异同,指导突变体库更靠谱的设计。
用两种不一样的方法增添酯酶对分解一种手性合成子2-***-3-溴丙酸的对
应选择性证了然较小型数据库的实效[42],采纳随机突变从不计其数的突变体中
挑选出200个,酶的E值(使一种对应体转变为另一种的酶的选择性)从
12增
加到19(见43)。认识到获取一个适用性的()需要两个对映体间差别活化能(△
G+)一个相对较小的增添(kcal/mol),突变形成集中于活性位点。一个包含在四个位点出现的所有可能的单点突变(76个突变体)的数据库,能够产生一个E值561(△△△G+)的酶。认识了需要解决的问题的要点主要在于从较小型数据库中酶的优化方法以及提出更大的改良。对于此点,提出了一种相当有价值的新方法进行连续定向进化,它可用于噬菌体侵染系统与大肠杆菌重组质粒的联合[44]。
工业生物催化中工程酶的实例
据Schmid等2001年前瞻性综述展望[29],过去的十年里已报导辅因子连续重生和酶的宽范围。但是,生物芯片和组合生物催化的展望应用还没有实现。非代谢细胞生物催化的使用已证明比预期要困难得多,并且这一策略已转向用于未加工和半纯化形式的工程酶。鉴于史上一种全细胞能够供给一个简单高效选择的辅因子重生以及酶稳固性增强,当前蛋白质工程和单酶的使用被以为更为经济实
用。单酶的使用还用其余的优势:更易去除(加入量更少,因为每单位质量拥有更高的活性),耐受更苛刻的条件,除去细胞膜造成的潜伏的扩散限制,并且更
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简单运输到细胞各处。比如,当前鉴于KRED的过程取代了全细胞复原反响和基
于金属配体的化学催化作用,过去的十年里这些曾是工业标准[45,46]。全细胞
过程是一个例外,它能够将外消旋的海因变换成光学纯的,非天然存在的一种氨
基酸。发现重组大肠杆菌成为一个简单高效的生产系统,同时表达海因酶,氨甲
酰水解酶和消旋酶,取代了在连续的固定床反响器中,以三种固定酶酶基础的原
始的加工方法[47,48]。别的,全细胞过程不需要代谢通量控制以及进行中没有
非预期的副反响。
图3阿托伐他汀(立普妥)要点侧链合成不一样的酶催化门路
这些门路采纳KRED与卤醇脱卤酶(HHDH)的联合(门路1),***水解酶(门路2),或是醛缩
酶(门路3)。它们的差别不单是酶的不一样,也有(低价)原资料的选择、生物催化剂活性
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和选择性,下游加工,以及最后产物产量和纯度。门路

1,2

获取一个立体中心,但是门路

3
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能够同时获取后期医药中间体的两个立体中心

[52]。紧接着门路

1,2

引进第二个手性中心也
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是经过应用

KRED达成的。

LDA,二异丙基氨基锂;

t-Bu

,叔丁基;

THF,四氢呋喃。
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KREDs和其余酶都已宽泛用于研究药物手性中间体的制造,比如阿托伐他汀
是立普妥的有效成分,是一种降胆固醇药物,2010年全世界销量为11,900,000,000
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美元。七种酶促门路[2,49,50](图3)已成熟,其不一样不单是酶和原资料的选择,并且对于产物是不是一种物质(单调手性中心)或是后期中间产物(两个手性中心)。在所有状况下,成功需要蛋白质工程来提高反响速率,对应选择性,
高底物浓度(高达3M,例在***水解酶过程中[51])的稳固性,或高溶剂浓度(KRED催化过程中20%乙酸丁酯[52])。除了高活性的生物催化剂,低成本过程也需要
低价的原料和简单的单调高产率产物的分别。通用的一种产生后期中间产物的方法采纳3步生物催化:一,KRED和葡萄糖脱氢酶的联合;二,与卤醇脱卤酶的
联合以>100tyr-1生成R(-)-4-***基-3-羟基丁酸乙酯中间物(图
3);三,后期二
醇中间产物的酶促复原反响[52]。
近来工程[17]扩大了转氨酶转变为带有两个大的取代基的***类的底物范围。酶工程从一个小的***底物开始,在活性位点产生更大的空间,并且利用愈来愈多的***类。几个循环的定向进化增添了它的活性~40,000倍,并且获取一个改造的氨基转移酶(图4),其能够取代鉴于过分金属加氢催化西他列汀的生产。开端于ATA-117,一个与对底物未检测到活性的野生型酶高度同源的酶,第一次突变
体获取特别低的活性(%转变率,2gl-1底物,10gl-1酶)转变为prositagliptin;最后的突变体将200gl-1的***转变为西他列汀转变率为92%,%的旋光异构体。生物催化过程不单降低了整体的浪费和清除了所有的过渡金属,并且相对于金属催化过程增添了53%的整体产量和生产率[18]。医药公司众多的生物催化路线渐渐增添(表1),显示了它们与传统化学反响的竞争力。
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图4生物催化推动合成化学
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