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野外采样实验
野外取样实验方案（201604）
实验目的
研究自然条件下东南景天不同生育期间，其内生菌多样性的动态变化。
实验设计
选择在东南景天的苗期、开花期、成熟期，于浙江衢州铅锌矿山采集具有代表性5个样点的超累积生态温湿热灭菌121℃,20min。
挑选不同的菌落到新的培养基，纯化1次。
挑单个菌落到R2A液体培养基中，30 ℃、160r/min，摇床12-16小时，摇到对数期或对数末期，测OD值，取700 uL菌液并加300 uL 50%甘油于甘油管中，保存，每个菌保存3个甘油管。
实验三 CTAB法提取植物内生菌DNA
实验目的
利用CTAB法提取植物内生菌DNA，保存待测。
实验原理
十六烷基三***溴化铵 (hexadecyltrimethylammonium bromide, CTAB)是一种阳离子去污剂，具有从低离子强度溶液中沉淀核酸与酸性多聚糖的特性。在高离子强度的溶液中(> NaCl)，CTAB与蛋白质和多聚糖形成复合物，只是不能沉淀核酸。通过有机溶剂抽提，去除蛋白，多糖，酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。
3. 实验材料（实验分3批完成）
1） 液氮；
2） 研钵6个，干热灭菌；
3） CTAB DNA提取液：
a. 100 mM Tris-HCl () 提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏；
b. 20 mM EDTA () 螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase活性；
c. M NaCl提供一个高盐环境，使DNA蛋白复合物（DNP）充分溶解；
d. 2 % (w/v) CTAB (cetyltrimethyl ammonium bromide) 溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离；
e. 1% PVP 40,000 (polyvinyl pyrrolidone) (聚乙烯吡咯烷***)是酚的络合物，能与多酚形成一种不溶的络合物质，有效去除多酚，减少DNA中酚的污染；同时它也能和多糖结合，有效去除多糖。
将上述试剂混合后，灭菌20分钟，常温保存；
4） 酚***仿异戊醇 按照酚:***仿:异戊醇=48:48:4 的比例配置[蛋白质变性，同时抑制了DNase的降解作用。用苯酚处理匀浆液时,由于蛋白与DNA 联结键
已断,蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而DNA溶于水相。使用酚的优点：；2抑制了DNase的降解作用。
缺点：-15%的水，从而溶解一部分poly(A)RNA。；
5) ***仿异戊醇 按照***仿:异戊醇=96:4 的比例配置。能克服酚的缺点；加速有机相与液相分层。最后用***仿抽提：去除核酸溶液中的迹量酚（酚易溶于***仿中）；
6) 异丙醇 沉淀DNA；
7) 70%的酒精 清洗DNA；
8) 2 mL的离心管各18个，高温湿热灭菌。
4. 实验步骤
1） 收集大约100 mg的植物样品，在使用前保存于-80 ℃ 。
2） 将样品放于研钵中，配合液氮，快速将样品磨成粉末状，将粉末尽量收集于一个2 mL的离心管中。
3） 将步骤2中的离心管中加入