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The promotion of cerebral ischemia recovery in rats by laminin-binding BDNF
层粘连蛋白结合脑源性神经营养因子促进大鼠脑缺血复苏
中国科学院遗传与发育生物学研究所
来源
《生物材料》(Biomaterials)(Doi:.)
脑缺血(脑梗塞)是由于脑动脉狭窄加重或完全闭塞,导致脑组织缺血、缺氧、坏死,从而引起神经功能障碍的一种脑血管病。
脑缺血是很常见的中枢神经损伤,其主要致病因素有:高血压病、冠心病、糖尿病等,多见于45~70岁中老年人。
生存下来的脑缺血损伤病人大都会有后遗症,影响正常生活,严重的脑缺血病人生活不能自理甚至危及生命安全。
中枢神经再生是再生医学的研究热点之一。
病况简洁
脑源性神经营养因子(BDNF)对神经元的缺血性损伤具有防治作用, 可望成为新一代的缺血性脑血管病的有效治疗药物。但因BDNF 属蛋白质大分子物质, 难透过血脑屏障, 为此影响了其临床应用。
层粘连蛋白(Laminin)一种丰富的细胞外基质。在中枢神经系统中,脑缺血后在缺血区域高度表达。
我们这里融合层粘连蛋白结合域(laminin-binding domain,LBD,NtA插入pET-28a形成PET-LBD)和BDNF形成LBD-BDNF。LBD-BDNF可以针对累积层粘连蛋白,在缺血区,发挥靶向治疗缺血损伤后神经元。
名词介绍
LBD-BDNF的构造
Gene of NtA was constructed and inserted into pET-28a (Novage, San Diego, CA) to construct pET-LBD as described before.
A human BDNF DNA was amplified by PCR as described before.
The BDNF DNA fragments were inserted individually into pET-LBD and pET-28a to construct the expression vectors for BDNF with LBD (pET-LBD-BDNF) or without LBD (pET-NAT-BDNF).
BL21 (DE3) strain-carried pET-LBD-BDNF or pET-NAT-BDNF were cultured.
检测纯化
The expression of binant proteins was analyzed by electrophoresis on a 15% (wt/vol) sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) under reducing condition and western-blotting with mouse antibody to polyhistidine (1:1000 dilution; Sigma).
The purified NAT-BDNF or LBD-BDNF was refolded in the glutathione redox-refolding system, and stored at −80 °C.
模拟
体外电泳分析层粘连蛋白结合能力
通过十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)测定纯化的NAT-BDNF和LBD-BDNF 。使用ELISA分析以确定是否LBD-BDNF具有层粘连蛋白结合能力。在每个指示的点,在OD 405 nm处的LBD-BDNF为显着高于的NAT-BDNF,表明LBD-BDNF对层粘连蛋白结合能力大于NAT-BDNF
体内
外科手术(封堵装置送到前动脉)对大鼠脑缺血模型的永久性大脑中动脉闭塞(MCAO),制备了大鼠大脑中动脉堵塞的脑缺血模型
24只大鼠
control组
NAT-BDNF组
LBD-BDNF组
层粘连蛋白在体内的结合分析