人鼠嵌合抗体.docx

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人鼠嵌合抗体特点
(1)既保留了亲本鼠抗体的高特异性和亲和力,又使鼠源性成分减少70%左右;
(2)其人源Fc段能有效介导生物学效应功能,如抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用
(ADCC)、补体依赖性细胞毒作用(CDC)等;
(3)能自由地选择抗体的型、亚型、类、亚类、大小、结构域及添加糖基化位点等以利用其不同的生物学特点及理化特性;
(4)由高效真核表达载体和人抗体恒定区组成的嵌合抗体表达“盒子”可以容许插入不同的鼠单克隆抗体的可变区,缩短操作和研制周期;
(5)操作相对简单。
技术与方法
可变区基因克隆
RNA提取及反转录
取对数生长期的杂交瘤细胞株(约107个细胞),按照TrizolRNA提取试剂盒的说明书抽提细胞的总RNA,再进行RT-PCR扩增,回收纯化扩增产物备用。
扩增轻链、重链的V区基因
根据Orlandi等(1989)设计的扩增小鼠可变区基因的引物,以上述扩增产物为模板扩增抗体基因的可变区。回收重链VH(约360bp)、轻链VL(约330bp)片段,插入T-easy载体,各送3份样品测序。测序所得序列在GeneBank核酸数据库中进行分类及同源性分析。
两端加入酶切位点根据上述PCR产物序列设计含酶切位点的引物,再次进行扩增,以使抗体可变区基因片段具有与载体相吻合的酶切位点,便于插入表达载体。回收纯化扩增产物备用。
嵌合抗体表达载体构建
改造含信号肽及人工Ig重链和轻链C区基因片段的单克隆位点
(1)设计含重链信号肽起始位点序列及酶切位点NheI的上游引物HLF(KOZAK+4G,即GCCGCCATGG),和含XhoI工位点的下游引物HLR,以质粒pAc*CH3为模板,扩增出重链信号肽基因片段;
(2) 设计含XhoI和KpnI位点上游引物HCF,和含Furin(RKRR)序列及酶切位点XbaI的下游引物HCR,以质粒pAc*CH3为模板,扩增出重链恒定区基因片段;用XhoI连接上述片段得到含重链信号肽、MCS及重链恒定区的基因片段;
(3) 设计含酶切位点ApaI的上游引物LLF,和含EcoRI位点的下游引物LLR,以质粒pAc-K-CH3为模板,扩增出轻链信号肽基因片段;
(4) 设计含EcoRI和HindIII位点上游引物LCF,和含PmeI的下游引物LCR,以质粒PAC-K-CH3为模板,扩增出轻链恒定区基因片段;用EcoRI连接上述片段得到含轻链信号肽、MCS及轻链恒定区的基因片段。
构建含信号肽及人工Ig重链和轻链C区基因片段表达空载体
(1)用合成的含酶切位点(XbaI和ApaI)的2A序列连接上述重、轻链,得到含信号肽及人Ig重链及轻链C区基因的基因片段LigC(Leader+IgConstant)。
(2) -CA大片段连接,-CA(chimericantibody,CA)。
图1:
插入含鼠源Ig重链和轻链V区基因
(1) -CA和纯化的VL,经琼脂糖凝胶电泳分离纯化目的片段后,连接、转化大肠杆菌,-CA-VL阳性克隆,富集培养后提取质粒进行酶切鉴定。
(2) -CA-VL和纯化的VH,分离纯化相应的酶切片段。
(3) 重复上述步骤,-CA-XX(抗原单词的首字母)。
转染Sp2/0细胞
接种适量Sp2/0细胞与培养瓶中,-CA-XXDNA,采用Lipofectamine2000试剂转染,按试剂盒使用说明书进行。设置空载体和无载体的细胞为对照。转染72h后,加含MTX的选择性培养基进行筛选。2周后将生长出的阳性克隆利用有限稀释法单克隆化。
阳性克隆鉴定与筛选
以间接法用抗原和酶标羊抗人IgGFc片段抗体检测嵌合抗体的特异性及重组性。以适量抗原包被酶标板,加细胞培养上清反应后,再加羊抗人IgGFc片段-HRP酶标抗体(经鼠Ig吸附过)孵育,显色后测A490吸光值。
抗体腹水生产
腹腔种植转染瘤细胞,5-7天后抽取腹水。一只种植杂交瘤细胞的小鼠有时可产生多达10ml的腹水。