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食品与发酵工业
FoodandFermentationIndustries
ISSN0253-990X,CN11-1802/TS
《食品与发酵工业》网络首发论文
题目:双果糖酐水解酶分子改造提升酶活性研究
作者:徐寒冰,郁书怀
DOI:.11-1802/
收稿日期:2022-04-12
网络首发日期:2022-06-21
引用格式:徐寒冰,[J/OL].食品与发
:///-1802/
网络首发:在编辑部工作流程中,稿件从录用到出版要经历录用定稿、排版定稿、整期汇编定稿等阶
段。录用定稿指内容已经确定,且通过同行评议、主编终审同意刊用的稿件。排版定稿指录用定稿按照期
刊特定版式(包括网络呈现版式)排版后的稿件,可暂不确定出版年、卷、期和页码。整期汇编定稿指出
版年、卷、期、页码均已确定的印刷或数字出版的整期汇编稿件。录用定稿网络首发稿件内容必须符合《出
版管理条例》和《期刊出版管理规定》的有关规定;学术研究成果具有创新性、科学性和先进性,符合编
辑部对刊文的录用要求,不存在学术不端行为及其他侵权行为;稿件内容应基本符合国家有关书刊编辑、
出版的技术标准,正确使用和统一规范语言文字、符号、数字、外文字母、法定计量单位及地图标注等。
为确保录用定稿网络首发的严肃性,录用定稿一经发布,不得修改论文题目、作者、机构名称和学术内容,
只可基于编辑规范进行少量文字的修改。
出版确认:纸质期刊编辑部通过与《中国学术期刊(光盘版)》电子杂志社有限公司签约,在《中国
学术期刊(网络版)》出版传播平台上创办与纸质期刊内容一致的网络版,以单篇或整期出版形式,在印刷
出版之前刊发论文的录用定稿、排版定稿、整期汇编定稿。因为《中国学术期刊(网络版)》是国家新闻出
版广电总局批准的网络连续型出版物(ISSN2096-4188,CN11-6037/Z),所以签约期刊的网络版上网络首
发论文视为正式出版。
:.
食品与发酵工业
双果糖酐水解酶分子改造提升酶活性研究
徐寒冰,郁书怀*
(江南大学食品学院,江苏无锡,214122)
*通信作者郁书怀副研究员,E-mail:******@
摘要双果糖酐水解酶(difructoseanhydrideIIIhydrolase,DFA-Ⅲase)能将新型功能甜味剂双果糖酐转化为益生元菊
二糖,然而DFA-IIIase酶活性较低,为了提高DFA-IIIase酶法合成菊二糖的能力,该研究对来源于Arthrobacter
chlorophenolicusA6的双果糖酐水解酶AcDFA-Ⅲase进行分子改造。基于已有的AcDFA-Ⅲase的晶体结构,选择酶活
性口袋上方loop区和活性口袋中的14个关键位点进行定点突变,得到17种DFA-Ⅲase突变体。利用96孔板作为高
通量培养容器,结合DNS法快速测定酶活性,初筛得到一个酶活性提高的突变体D380A。用HPLC法测定分离纯化
出的酶活性,验证结果表明其酶活性确实有显著提高,酶比活性是AcDFA-Ⅲ%。同源建模分析,380位天
冬氨酸突变成丙氨酸后,loop环区域疏水性增强,保证了催化中心的疏水微环境,提高了酶的催化活性。该研究建立
的高通量检测方法为DFA-Ⅲase的筛选以及菊二糖的大量生产奠定了基础。
关键词双果糖酐水解酶;定点突变;96孔板;高通量筛选;同源建模
DOI:.11-1802/
Theresearchonmolecularmodificationofdifructoseanhydridehydrolaseto
improveitsenzymaticactivity
XUHanbing,YUShuhuai*
(SchoolofFoodScienceandTechnology,JiangnanUniversity,Wuxi214122,China)
AbstractDifructoseanhydrideIIIhydrolase(DFA-Ⅲase)isanenzymethatcanconvertthenovelsweetenerdifructose
anhydride(DFA-III),theactivityofDFA-,toobtainthe
DFA-ⅢasewithahigherabilitytosynthesizeDFA-III,aDFA-IIIasefromArthrobacterchlorophenolicusA6namely
AcDFA-Ⅲasewasmolecularlymodified,inordertoobtainthedifructoseanhydrideIIIhydrolasewithexcellentenzymatic
-
Ⅲase,14keysiteslocatedattheactivepocketandloopregionabovetheactivepocketwereselectedforsite-directed
mutagenesis,
using96wellplateasthehigh-throughputculturecontainerandDNScolorimetryastheassaymethodofenzymaticactivity
HPLC,andtheresultshowedthatenzymeactivityofD380Awassignificantlyimproved,%ofAcDFA-
Ⅲ,aftermutationoftheasparticacidresidueatsite380waschangedto
alanine,thehydrophobicityofloopregionwasenhanced,whichguaranteedthehydrophobicmicroenvironmentandimproved
-throughputdetectionmethodestablishedinthisstudylaysafoundationforthe
screeningofdifructoseanhydrideIIIhydrolaseDFA-IIIaseandthemassproductionofinulobiose.
KeywordsDFA-Ⅲase;site-directedmutagenesis;96-wellplates;high-throughputscreening;homologousmodelling
菊粉(菊糖)是自然界中资源丰富的功能性低聚果糖,主要存在于菊科类植物中,具有改善肠道
微生态,促进益生菌增殖,调节血糖、血脂,改善便秘,促进矿物质的吸收以及减少患癌风险等功
收稿日期:2022-04-12
基金项目:国家自然科学基金-青年基金(31901630);江苏省基础研究计划(自然科学基金)一青年基金(BK20190583);江南大学
中央高校基本科研计划-青年基金(JUSRP12007)
第一作者:硕士研究生
网络首发时间:2022-06-2111:44:43网络首发地址:.
:.
2食品与发酵工业
能,在乳制品、面制品、肉制品加工中有广泛的应用[1]。菊糖有多条代谢途径,其中一条途径是利用
菊粉外切酶将菊粉分解为果糖[2],利用菊粉内切酶将菊糖降解为菊粉型低聚果糖[3]。菊粉型低聚果糖
是不同聚合度的低聚果糖的混合物,如菊二糖(果果二糖)、菊三糖(果果三糖)、菊四糖(果果四
糖)、菊五糖(果果五糖)、蔗果三糖、蔗果四糖和少量果糖,可发挥益生元作用,较好地改善妊娠
期的糖脂代谢,促进矿物质吸收,调节体内菌群平衡以及增强机体免疫力[3-6]。另一条途径是利用菊
糖果糖转移酶(inulinfructotransferase,IFTase)降解菊糖为双果糖酐(difructoseanhydride,DFA),
菊糖可被三型菊糖果糖转移酶IFTase-Ⅲ(DFA-Ⅲ-forminginulinfructotransferase,)和一
型菊糖果糖转移酶IFTase-Ⅰ(DFA-I-forminginulinfructotransferase,)分别酶解为三型双
果糖酐DFA-III和一型双果糖酐DFA-I[7-8]。DFA-Ⅲ是一种功能性甜味剂,能量低,可以促进矿物质
的吸收,降低胆固醇,抗龋齿,增殖有益菌[9]。DFA-III可被DFA-Ⅲase进一步水解为菊二糖。菊糖
这2条代谢途径都生成了菊二糖,其中菊糖,菊粉型低聚果糖和DFA-III都具有特殊的功能,菊二糖
却没有相关研究报道。另外,对低聚果糖的研究,多是直接研究混合糖的作用,没有分离出单一的
糖,不能确定是哪种成分起作用,或是多种糖起协同作用。这主要由于酶法制备的低聚果糖为多种成
分的混合体,其单一成分难以实现规模化合成以及纯化。
基于低聚果糖的生理功效,推测菊二糖也是一种具有特殊功能的糖,然而其研究受限于合成。菊
二糖自然存在于牛蒡等植物的根茎和香蕉等水果内[10-11],但是量很少,且与其他糖分离困难。酶法生
产菊二糖有较大潜力,蔗糖转化酶(sucroseinvertase)催化的蔗糖转糖基反应中,不仅生成了果糖和
葡萄糖,同时还生成了菊二糖,1-蔗果三糖,6-蔗果三糖,新蔗果三糖,但是果糖和葡萄糖是主要产
物[12]。菊粉酶(inulinase)和DFA-IIIase也能催化获得菊二糖。菊粉酶水解菊粉得到的低聚果糖,主
要成分为菊三糖、菊四糖,而菊二糖相对较少[3,13]。DFA-IIIase能够水解DFA-III获得单一的菊二
糖,无其他副产物产生,因此,DFA-IIIase在合成菊二糖方面有望成为一种关键酶。1975年,具有水
解DFA-Ⅲ[14]。1997年,DFA-Ⅲase在Arthrobactersp.
H65-7中被分离纯化出,,温度60℃时转化DFA-III为菊二糖的活性最高,同时该酶具
有可逆催化功能,即催化菊二糖转化为DFA-Ⅲ[15]。2003年SAITO等实现了DFA-Ⅲase基因在大肠
杆菌(Escherichiacoli)中的异源表达[16]。2015年,本课题组YU等[17]从Arthrobacteraurescens
-Ⅲase编码基因,并将其在大肠杆菌中克隆和表达,开启了国内有关DFA-
IIIase的研究。通过凝胶过滤和SDS-PAGE电泳结果,得知该酶是相对分子质量为145kDa的同源三
聚体,℃时催化DFA-III的活性最高。2019年,本课题组YU[18]鉴定出了Arthrobacter
chlorophenolicusA6中的DFA-Ⅲase,该酶是首个被报道能同时降解菊糖为DFA-Ⅲ,并催化DFA-Ⅲ
水解为菊二糖的酶,即该酶具有连续催化性,其晶体结构也被首次解析出。关于DFA-Ⅲase的研究目
前仍然较少,且活性都较低,因此,获得活性高、专一性强的DFA-Ⅲase对于菊二糖的研究至关重
要。
本研究对来源于ArthrobacterchlorophenolicusA6的AcDFA-Ⅲase进行分子改造,以期得到酶活
性提高的突变体。同时,由于设计的突变体数量较多,一一纯化测定酶活性,将十分耗时繁琐。糖分
析方法主要有色谱法,比色法和滴定法等[19]。色谱法准确,但是耗时,滴定法不适用于大批量样品的
测定。比色法利用紫外-可见分光光度法和标准曲线进行定量分析,有苯酚-硫酸法,蒽***-硫酸法,
3,5-二硝基水杨酸(DNS)法,前2种方法利用浓硫酸将多糖水解为单糖并脱水生成糖醛,再和苯
酚/蒽***生成有色化合物,利用分光光度计测量[19]。DNS法的原理是还原糖在碱性条件下与DNS反应
生成红棕色化合物,且颜色深浅在一定范围内与还原糖的量成正比,准确性高,重复性好,被广泛使
用[20-21]。鉴于菊二糖是一种还原糖[14],可以利用DNS法检测。另外,高通量筛选技术可以大大提高
筛选效率[22-23],所以本研究采用96孔板进行高通量培养,配合DNS法快速检测酶活性,成功筛选出
了高酶性性的突变体。为DFA-Ⅲase突变体文库的快速筛选,菊二糖的大量生产,性质研究以及菊糖
这一代谢途径的补充奠定了基础。
:.
徐寒冰等双果糖酐水解酶分子改造提升酶活性研究3
1材料与方法
(DE3)、,生工生物工程(上海)股份有限公司、含
ArthrobacterchlorophenolicusA6来源的DFA-IIIase基因的重组质粒pET22b-AcDFA-IIIase由生工生物
工程(上海)股份有限公司合成,保藏在本实验室。
PrimeSTARHSDNAPolymerase高保真酶和DpnI消化酶,TaKaRa公司。
LB培养基(g/L):胰蛋白胨10,酵母粉5,NaCl10,,固体培养基在此基础上
加入2%琼脂粉,121℃高压灭菌20min。液体培养基中加入氨苄青霉素至50μg/mL,固体培养基中
添加至100μg/mL。配好的液体培养基于室温存放,平板置于4℃冰箱存放。
纯化所用缓冲液:参考YU[18]文章中的缓冲液配制,Bindingbuffer:500mmol/LNaCl、50
mmol/LNaH2PO4和50mmol/LNa2HPO4,;Washbuffer是在Bindingbuffer基础上添加50
mmol/L的咪唑,用于洗除杂蛋白;Elutionbuffer是在Bindingbuffer基础上添加200mmol/L咪唑,
用于洗脱结合在柱子上的目的蛋白;酶透析液I是Bindingbuffer中不添加NaCl和咪唑但添加10
mmol/LEDTA,用于去除蛋白溶液中的高浓度盐分和金属离子;酶透析液II是在透析液I的基础上不
添加EDTA,目的是进一步去除溶液中的盐分、金属离子以及EDTA。
DNS试剂:,,5-二硝基水杨酸,
,搅拌至溶解,冷却后定容至100mL,贮于棕色瓶中,室温保存,放置1周
后使用。
PCR仪ProFlex,美国赛默飞公司;微量分光光度计Nano-300,杭州奥盛公司;酶标仪,南京拜
尔沃公司;电泳仪,美国BIO-RAD公司;凝胶成像仪4600SF,上海天能公司;离心机卢湘仪GL-
21MS,卢湘仪离心机仪器有限公司;台式摇床,上海知楚仪器公司;超声波细胞粉碎机-粗频变杆,
南京非奇经贸。
基于AcDFA-IIIase生物信息学分析、晶体结构,理性设计突变位点。基于AcDFA-Ⅲase基因序
列设计含有突变氨基酸的PCR引物,序列见表1,其中C387A是重复本课题组之前的工作[18]。以重
组质粒pET22b-AcDFA-IIIase为模板,通过重叠延伸PCR引进突变。PCR体系:5×PrimeSTARBuffer
10μL,dNTPMixture4μL,引物各100pmol,模板10ng,,加入灭菌水至50
μL。反应条件为:98℃预变性3min,98℃变性10s;55℃退火5s,72℃;72℃延伸
10min。PCR产物用DpnI酶消化质粒模板,,涂布于含有氨苄青
霉素的抗性平板上,过夜培养后挑取单菌落送生工生物工程(上海)股份有限公司测序,测序成功后
返回质粒,(DE3)感受态细胞中,涂布于抗性平板,37℃过夜培养得到重组菌。
表1定点突变所用引物
Table1Primersforsite-directedmutagenesis
引物核苷酸序列(5’-3’)
T310K-FCATGAACCGTGGAAGCCGTTT
T310K-RCCAAAAAACGGCTTCCACGGTTC
A209C-FTCATAATTTTATTTGCGAATGTGGTTCT
A209C-RGAACCACATTCGCAAATAAAATTATGATG
S82C-FTGGCTTTACCTGCTCAAGCATTCG
:.
4食品与发酵工业
S82C-RGAATGCTTGAGCAGGTAAAGCCATG
V89T-FTCGCTTTAATACTCCGGAAGAAGAATGGC
V89T-RTCTTCTTCCGGAGTATTAAAGCGAATGCT
R270A-FGGCGTCACCGCTTCTTCAGTTACCAAT
R270A-RTTGGTAACTGAAGAAGCGGTCACGCCT
E294A-FTTCTAGTGCTAATCTGGTTGCCACCAATC
E294A-RTGGTGGCAACCAGATTAGCACTAGAAT
T310A-FCATGAACCGTGGGCTCCGTTT
T310A-RCCAAAAAACGGAGCCCACGGTTC
V379E-FCGATGGATGAGGATGCAGCAAGTAGCG
V379E-RGCTACTTGCTGCATCTCATCCATCGC
D380A-FTGGATGTTGCTGCAGCAAGTAGCGATAGC
D380A-RCTACTTGCTGCAGCAACATCCATCGCAAC
A381T-FGGATGTTGATACTGCAAGTAGCGATAGCTG
A381T-RGCTATCGCTACTTGCAGTATCAACATCC
S132A-FCGAAGGCGCTCCGCGCATTAGT
S132A-RTAATGCGCGGAGCGCCTTCGC
W220A-FCTGCGCGGTGCTGGTCAGGC
W220A-RGCCTGACCAGCACCGCGCAGTT
W220S-FCTGCGCGGTTCTGGTCAGGCC
W220S-RGCCTGACCAGAACCGCGCAGTTC
F388A-FAGCTGTGCTGAAGCCCAGGTGGAT
F388A-RTGGGCTTCAGCACAGCTATCGCTACT
A397T-FTGCCCTGTTAACCACCGAAGCAGC
A397T-RCTTCGGTGGTTAACAGGGCATCCACC
C387A-FGTCGAGTGACTCCGCCTTCGAAGCCCAGG
C387A-RGGCGGAGTCACTCGACGCAGCGTCCACATCCAT
A209D-FTCATAATTTTATTGACGAATGTGGTTCTTG
A209D-RGAACCACATTCGTCAATAAAATTATGATG
A209S-FTCATAATTTTATTAGTGAATGTGGTTCT
A209S-RGAACCACATTCACTAATAAAATTATGATG
注:下划线部分是引入突变的位点
在已灭菌的超净工作台中,用移液排枪将LB培养基分装在灭完菌的96深孔板中,每孔分装600
μL。用灭菌枪头/牙签挑取单菌落,转至深孔板中,用已灭菌的纱布或96孔板硅胶盖封住深孔板。将
96孔板固定在摇床上,37℃,900r/min培养过夜。按2%(体积分数)接种量转接至装有600μLLB
培养基的96深孔板,37℃,900r/min,~,向孔板中添加终浓度为1mmol/L
的IPTG,于28℃低温诱导6h。发酵结束后,对深孔板进行离心,向其中加入200μL溶菌酶(750
g/L)进行破碎,并加入400μL磷酸盐缓冲液进行稀释。使用DNS法来测定酶活性,直接在96孔板
中进行反应,用酶标仪批量测定540nm下的吸光值,DNS法测酶活性时,酶活性定义:,
55℃下,每分钟生成1μg葡萄糖还原当量的还原糖所需的酶量为1个酶活性单位。
将初筛得到的酶活性提高的突变体菌株接种于10mL含氨苄青霉素抗性的LB液体培养基中,
37℃、200r/min条件下培养过夜后,按2%接种量转接至200mL含氨苄青霉素抗性的LB液体培养
基中,37℃、200r/min条件下,~,加入IPTG(终浓度为1mmol/L),置
于28℃摇床中培养6h,在4℃、10000r/min下离心15min收集细胞,用磷酸盐(,浓度为
:.
徐寒冰等双果糖酐水解酶分子改造提升酶活性研究5
50mmol/L)缓冲液洗涤并悬浮,在冰水浴的条件下用超声破碎仪破碎细胞(300W,超1s,停2s,
破碎10min),破碎液在冰水浴条件下离心15min,取上清液用于后续的蛋白纯化。蛋白纯化采用
Ni-NTA柱亲和层析方法,用不同浓度的咪唑进行洗脱,收集各部分洗脱液。收集液进行SDS-PAGE
电泳,验证纯度。得到纯酶后,用HPLC法进行酶活性测定。
酶活性测定:酶促反应体系1mL包括10g/LDFA-III、100nmol/L纯酶液、50mmol/L磷酸盐缓
冲液(),反应温度55℃,反应时间为10min。沸水浴灭酶活性后,在10000r/min转速下,
离心10min,上清液过膜后进行HPLC检测。色谱柱:NH2P-504E氨基柱,流动相:65%乙***,流
速:1mL/min,柱温30℃,检测器:示差折光检测器。HPLC法测定时的酶活性定义为:在pH
,55℃下,每分钟生成1μmol菊二糖所需的酶量为一个单位酶活性U。
最适温度:分别在30~80℃(间隔5℃)下测定酶活性,把最适温度下的酶活性定义为100%,
计算其他温度下的相对酶活性。
最适pH:通过柠檬酸钠盐缓冲液(~)、磷酸盐缓冲液(~)、Tris-HCl缓冲
液(~)配制10g/L的DFA-Ⅲ底物,在最适温度条件下反应后测酶活性力,把最适pH下的
酶活性定为100%,计算其他pH下的相对酶活性。
动力学研究:100nmol/~50mmol/L的DFA-℃时反应
10min。反应后测定酶活性,根据双倒数法或者非线性拟合方法计算动力学参数。
将D380A氨基酸序列提交至SWISS-MODEL在线蛋白质模型构建服务器
(-)进行同源建模,模式选定为自动构建模式。选
定AcDFA-IIIase晶体结构(PDB登录号:5ZKS))作为模板进行三聚体结构的构建,模型的立体化
学质量主要是通过Wincoot软件的拉氏构象图来判定,而原子模型(3D)和氨基酸序列(1D)兼容
性的合理性是通过ASVES服务器的VERIFY-3D模块进行判定(/)。
最后使用可视化软件PyMOL对模拟结构进行展示和分析。
2结果与讨论
AcDFA-Ⅲase的晶体结构已经被解析出(PDBID:5ZKS),AcDFA-Ⅲase和底物双果糖酐复合
物的结构也被解析出(PDBID:5ZKU),AcDFA-Ⅲase是一个同源三聚体,活性口袋位于两个相邻
亚基形成的裂缝中,口袋中心的活性残基分为亲水和疏水残基两部分,亲水残基有Ser84,Tyr163,
Glu210,Arg258,Gln391,Asp177,Asp199,Gln222,Phe80,Ile85,Phe256以及Trp309。活性口
袋正上方存在一个具有重要调控作用的loop环(将其称为活性口袋上方的盖子,区域为
Asp378~Asp402)[18],loop区是蛋白最柔性部分,保守性低,选择这个区域的氨基酸残基可以避免改
变酶蛋白的保守结构,而且活性中心以及盖子周围的氨基酸残基对催化起重要作用[24-25]。所以最终选
择了这些区域的关键位点进行理性设计,例如Ala209位点是关键催化位点Glu210附近的残基,
Ser82在活性口袋里,以及Thr310在活性口袋且与盖子交界处,Val379,Asp380,Ala381,Phe388,
Ala397处于盖子区域,改变这些位点的残基有可能影响到酶的催化能力。
-Ⅲase突变文库的高通量筛选
DNS法是还原糖测定常用的经典方法,但应用传统方法对大批量样品检测仍较繁琐,所以有必
要建立微型化DNS法。本研究利用微孔板进行还原糖与DNS试剂反应,并用酶标仪测定540nm波
长下的吸光度,结果如图1所示,在96孔板中进行DNS法比色时,,
线性良好,能满足实验测定的需要。而且利用96孔板作为反应容器时,一块板可以同时处理96个样
品,样品处理完再利用移液排枪转移至酶标板,几分钟内即可读取数据,操作简便;另外在96孔板
中反应时,反应体系小,可节约试剂。所以微孔板结合DNS法检测有望成为酶活性高通量分析的方
:.
6食品与发酵工业
法。
将设计的突变体利用96孔板同步发酵培养,DFA-Ⅲase在大肠杆菌中是以胞内酶形式表达,利
用96孔板对菌体进行发酵培养时,尽量保持每个孔的菌体浓度一致,为了保持结果的重复性,将同
一样品的重组酶液分装在深孔板中,利用粗酶和底物反应,采用DNS法对水解物进行测定。结果如
图2所示,对原始AcDFA-Ⅲase进行定点突变得到的突变体酶仍然具有水解双果糖酐的能力,但是
大部分突变体的酶活性大幅度降低,只有D380A和C387A的酶活性有明显提高。利用此方法测出
D380A的酶活性是AcDFA-Ⅲ%,C3
食品与发酵工业
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题目:双果糖酐水解酶分子改造提升酶活性研究
作者:徐寒冰,郁书怀
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摘要双果糖酐水解酶(difructoseanhydrideIIIhydrolase,DFA-Ⅲase)能将新型功能甜味剂双果糖酐转化为益生元菊
二糖,然而DFA-IIIase酶活性较低,为了提高DFA-IIIase酶法合成菊二糖的能力,该研究对来源于Arthrobacter
chlorophenolicusA6的双果糖酐水解酶AcDFA-Ⅲase进行分子改造。基于已有的AcDFA-Ⅲase的晶体结构,选择酶活
性口袋上方loop区和活性口袋中的14个关键位点进行定点突变,得到17种DFA-Ⅲase突变体。利用96孔板作为高
通量培养容器,结合DNS法快速测定酶活性,初筛得到一个酶活性提高的突变体D380A。用HPLC法测定分离纯化
出的酶活性,验证结果表明其酶活性确实有显著提高,酶比活性是AcDFA-Ⅲ%。同源建模分析,380位天
冬氨酸突变成丙氨酸后,loop环区域疏水性增强,保证了催化中心的疏水微环境,提高了酶的催化活性。该研究建立
的高通量检测方法为DFA-Ⅲase的筛选以及菊二糖的大量生产奠定了基础。
关键词双果糖酐水解酶;定点突变;96孔板;高通量筛选;同源建模
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AbstractDifructoseanhydrideIIIhydrolase(DFA-Ⅲase)isanenzymethatcanconvertthenovelsweetenerdifructose
anhydride(DFA-III),theactivityofDFA-,toobtainthe
DFA-ⅢasewithahigherabilitytosynthesizeDFA-III,aDFA-IIIasefromArthrobacterchlorophenolicusA6namely
AcDFA-Ⅲasewasmolecularlymodified,inordertoobtainthedifructoseanhydrideIIIhydrolasewithexcellentenzymatic
-
Ⅲase,14keysiteslocatedattheactivepocketandloopregionabovetheactivepocketwereselectedforsite-directed
mutagenesis,
using96wellplateasthehigh-throughputculturecontainerandDNScolorimetryastheassaymethodofenzymaticactivity
HPLC,andtheresultshowedthatenzymeactivityofD380Awassignificantlyimproved,%ofAcDFA-
Ⅲ,aftermutationoftheasparticacidresidueatsite380waschangedto
alanine,thehydrophobicityofloopregionwasenhanced,whichguaranteedthehydrophobicmicroenvironmentandimproved
-throughputdetectionmethodestablishedinthisstudylaysafoundationforthe
screeningofdifructoseanhydrideIIIhydrolaseDFA-IIIaseandthemassproductionofinulobiose.
KeywordsDFA-Ⅲase;site-directedmutagenesis;96-wellplates;high-throughputscreening;homologousmodelling
菊粉(菊糖)是自然界中资源丰富的功能性低聚果糖,主要存在于菊科类植物中,具有改善肠道
微生态,促进益生菌增殖,调节血糖、血脂,改善便秘,促进矿物质的吸收以及减少患癌风险等功
收稿日期:2022-04-12
基金项目:国家自然科学基金-青年基金(31901630);江苏省基础研究计划(自然科学基金)一青年基金(BK20190583);江南大学
中央高校基本科研计划-青年基金(JUSRP12007)
第一作者:硕士研究生
网络首发时间:2022-06-2111:44:43网络首发地址:.
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2食品与发酵工业
能,在乳制品、面制品、肉制品加工中有广泛的应用[1]。菊糖有多条代谢途径,其中一条途径是利用
菊粉外切酶将菊粉分解为果糖[2],利用菊粉内切酶将菊糖降解为菊粉型低聚果糖[3]。菊粉型低聚果糖
是不同聚合度的低聚果糖的混合物,如菊二糖(果果二糖)、菊三糖(果果三糖)、菊四糖(果果四
糖)、菊五糖(果果五糖)、蔗果三糖、蔗果四糖和少量果糖,可发挥益生元作用,较好地改善妊娠
期的糖脂代谢,促进矿物质吸收,调节体内菌群平衡以及增强机体免疫力[3-6]。另一条途径是利用菊
糖果糖转移酶(inulinfructotransferase,IFTase)降解菊糖为双果糖酐(difructoseanhydride,DFA),
菊糖可被三型菊糖果糖转移酶IFTase-Ⅲ(DFA-Ⅲ-forminginulinfructotransferase,)和一
型菊糖果糖转移酶IFTase-Ⅰ(DFA-I-forminginulinfructotransferase,)分别酶解为三型双
果糖酐DFA-III和一型双果糖酐DFA-I[7-8]。DFA-Ⅲ是一种功能性甜味剂,能量低,可以促进矿物质
的吸收,降低胆固醇,抗龋齿,增殖有益菌[9]。DFA-III可被DFA-Ⅲase进一步水解为菊二糖。菊糖
这2条代谢途径都生成了菊二糖,其中菊糖,菊粉型低聚果糖和DFA-III都具有特殊的功能,菊二糖
却没有相关研究报道。另外,对低聚果糖的研究,多是直接研究混合糖的作用,没有分离出单一的
糖,不能确定是哪种成分起作用,或是多种糖起协同作用。这主要由于酶法制备的低聚果糖为多种成
分的混合体,其单一成分难以实现规模化合成以及纯化。
基于低聚果糖的生理功效,推测菊二糖也是一种具有特殊功能的糖,然而其研究受限于合成。菊
二糖自然存在于牛蒡等植物的根茎和香蕉等水果内[10-11],但是量很少,且与其他糖分离困难。酶法生
产菊二糖有较大潜力,蔗糖转化酶(sucroseinvertase)催化的蔗糖转糖基反应中,不仅生成了果糖和
葡萄糖,同时还生成了菊二糖,1-蔗果三糖,6-蔗果三糖,新蔗果三糖,但是果糖和葡萄糖是主要产
物[12]。菊粉酶(inulinase)和DFA-IIIase也能催化获得菊二糖。菊粉酶水解菊粉得到的低聚果糖,主
要成分为菊三糖、菊四糖,而菊二糖相对较少[3,13]。DFA-IIIase能够水解DFA-III获得单一的菊二
糖,无其他副产物产生,因此,DFA-IIIase在合成菊二糖方面有望成为一种关键酶。1975年,具有水
解DFA-Ⅲ[14]。1997年,DFA-Ⅲase在Arthrobactersp.
H65-7中被分离纯化出,,温度60℃时转化DFA-III为菊二糖的活性最高,同时该酶具
有可逆催化功能,即催化菊二糖转化为DFA-Ⅲ[15]。2003年SAITO等实现了DFA-Ⅲase基因在大肠
杆菌(Escherichiacoli)中的异源表达[16]。2015年,本课题组YU等[17]从Arthrobacteraurescens
-Ⅲase编码基因,并将其在大肠杆菌中克隆和表达,开启了国内有关DFA-
IIIase的研究。通过凝胶过滤和SDS-PAGE电泳结果,得知该酶是相对分子质量为145kDa的同源三
聚体,℃时催化DFA-III的活性最高。2019年,本课题组YU[18]鉴定出了Arthrobacter
chlorophenolicusA6中的DFA-Ⅲase,该酶是首个被报道能同时降解菊糖为DFA-Ⅲ,并催化DFA-Ⅲ
水解为菊二糖的酶,即该酶具有连续催化性,其晶体结构也被首次解析出。关于DFA-Ⅲase的研究目
前仍然较少,且活性都较低,因此,获得活性高、专一性强的DFA-Ⅲase对于菊二糖的研究至关重
要。
本研究对来源于ArthrobacterchlorophenolicusA6的AcDFA-Ⅲase进行分子改造,以期得到酶活
性提高的突变体。同时,由于设计的突变体数量较多,一一纯化测定酶活性,将十分耗时繁琐。糖分
析方法主要有色谱法,比色法和滴定法等[19]。色谱法准确,但是耗时,滴定法不适用于大批量样品的
测定。比色法利用紫外-可见分光光度法和标准曲线进行定量分析,有苯酚-硫酸法,蒽***-硫酸法,
3,5-二硝基水杨酸(DNS)法,前2种方法利用浓硫酸将多糖水解为单糖并脱水生成糖醛,再和苯
酚/蒽***生成有色化合物,利用分光光度计测量[19]。DNS法的原理是还原糖在碱性条件下与DNS反应
生成红棕色化合物,且颜色深浅在一定范围内与还原糖的量成正比,准确性高,重复性好,被广泛使
用[20-21]。鉴于菊二糖是一种还原糖[14],可以利用DNS法检测。另外,高通量筛选技术可以大大提高
筛选效率[22-23],所以本研究采用96孔板进行高通量培养,配合DNS法快速检测酶活性,成功筛选出
了高酶性性的突变体。为DFA-Ⅲase突变体文库的快速筛选,菊二糖的大量生产,性质研究以及菊糖
这一代谢途径的补充奠定了基础。
:.
徐寒冰等双果糖酐水解酶分子改造提升酶活性研究3
1材料与方法
(DE3)、,生工生物工程(上海)股份有限公司、含
ArthrobacterchlorophenolicusA6来源的DFA-IIIase基因的重组质粒pET22b-AcDFA-IIIase由生工生物
工程(上海)股份有限公司合成,保藏在本实验室。
PrimeSTARHSDNAPolymerase高保真酶和DpnI消化酶,TaKaRa公司。
LB培养基(g/L):胰蛋白胨10,酵母粉5,NaCl10,,固体培养基在此基础上
加入2%琼脂粉,121℃高压灭菌20min。液体培养基中加入氨苄青霉素至50μg/mL,固体培养基中
添加至100μg/mL。配好的液体培养基于室温存放,平板置于4℃冰箱存放。
纯化所用缓冲液:参考YU[18]文章中的缓冲液配制,Bindingbuffer:500mmol/LNaCl、50
mmol/LNaH2PO4和50mmol/LNa2HPO4,;Washbuffer是在Bindingbuffer基础上添加50
mmol/L的咪唑,用于洗除杂蛋白;Elutionbuffer是在Bindingbuffer基础上添加200mmol/L咪唑,
用于洗脱结合在柱子上的目的蛋白;酶透析液I是Bindingbuffer中不添加NaCl和咪唑但添加10
mmol/LEDTA,用于去除蛋白溶液中的高浓度盐分和金属离子;酶透析液II是在透析液I的基础上不
添加EDTA,目的是进一步去除溶液中的盐分、金属离子以及EDTA。
DNS试剂:,,5-二硝基水杨酸,
,搅拌至溶解,冷却后定容至100mL,贮于棕色瓶中,室温保存,放置1周
后使用。
PCR仪ProFlex,美国赛默飞公司;微量分光光度计Nano-300,杭州奥盛公司;酶标仪,南京拜
尔沃公司;电泳仪,美国BIO-RAD公司;凝胶成像仪4600SF,上海天能公司;离心机卢湘仪GL-
21MS,卢湘仪离心机仪器有限公司;台式摇床,上海知楚仪器公司;超声波细胞粉碎机-粗频变杆,
南京非奇经贸。
基于AcDFA-IIIase生物信息学分析、晶体结构,理性设计突变位点。基于AcDFA-Ⅲase基因序
列设计含有突变氨基酸的PCR引物,序列见表1,其中C387A是重复本课题组之前的工作[18]。以重
组质粒pET22b-AcDFA-IIIase为模板,通过重叠延伸PCR引进突变。PCR体系:5×PrimeSTARBuffer
10μL,dNTPMixture4μL,引物各100pmol,模板10ng,,加入灭菌水至50
μL。反应条件为:98℃预变性3min,98℃变性10s;55℃退火5s,72℃;72℃延伸
10min。PCR产物用DpnI酶消化质粒模板,,涂布于含有氨苄青
霉素的抗性平板上,过夜培养后挑取单菌落送生工生物工程(上海)股份有限公司测序,测序成功后
返回质粒,(DE3)感受态细胞中,涂布于抗性平板,37℃过夜培养得到重组菌。
表1定点突变所用引物
Table1Primersforsite-directedmutagenesis
引物核苷酸序列(5’-3’)
T310K-FCATGAACCGTGGAAGCCGTTT
T310K-RCCAAAAAACGGCTTCCACGGTTC
A209C-FTCATAATTTTATTTGCGAATGTGGTTCT
A209C-RGAACCACATTCGCAAATAAAATTATGATG
S82C-FTGGCTTTACCTGCTCAAGCATTCG
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4食品与发酵工业
S82C-RGAATGCTTGAGCAGGTAAAGCCATG
V89T-FTCGCTTTAATACTCCGGAAGAAGAATGGC
V89T-RTCTTCTTCCGGAGTATTAAAGCGAATGCT
R270A-FGGCGTCACCGCTTCTTCAGTTACCAAT
R270A-RTTGGTAACTGAAGAAGCGGTCACGCCT
E294A-FTTCTAGTGCTAATCTGGTTGCCACCAATC
E294A-RTGGTGGCAACCAGATTAGCACTAGAAT
T310A-FCATGAACCGTGGGCTCCGTTT
T310A-RCCAAAAAACGGAGCCCACGGTTC
V379E-FCGATGGATGAGGATGCAGCAAGTAGCG
V379E-RGCTACTTGCTGCATCTCATCCATCGC
D380A-FTGGATGTTGCTGCAGCAAGTAGCGATAGC
D380A-RCTACTTGCTGCAGCAACATCCATCGCAAC
A381T-FGGATGTTGATACTGCAAGTAGCGATAGCTG
A381T-RGCTATCGCTACTTGCAGTATCAACATCC
S132A-FCGAAGGCGCTCCGCGCATTAGT
S132A-RTAATGCGCGGAGCGCCTTCGC
W220A-FCTGCGCGGTGCTGGTCAGGC
W220A-RGCCTGACCAGCACCGCGCAGTT
W220S-FCTGCGCGGTTCTGGTCAGGCC
W220S-RGCCTGACCAGAACCGCGCAGTTC
F388A-FAGCTGTGCTGAAGCCCAGGTGGAT
F388A-RTGGGCTTCAGCACAGCTATCGCTACT
A397T-FTGCCCTGTTAACCACCGAAGCAGC
A397T-RCTTCGGTGGTTAACAGGGCATCCACC
C387A-FGTCGAGTGACTCCGCCTTCGAAGCCCAGG
C387A-RGGCGGAGTCACTCGACGCAGCGTCCACATCCAT
A209D-FTCATAATTTTATTGACGAATGTGGTTCTTG
A209D-RGAACCACATTCGTCAATAAAATTATGATG
A209S-FTCATAATTTTATTAGTGAATGTGGTTCT
A209S-RGAACCACATTCACTAATAAAATTATGATG
注:下划线部分是引入突变的位点
在已灭菌的超净工作台中,用移液排枪将LB培养基分装在灭完菌的96深孔板中,每孔分装600
μL。用灭菌枪头/牙签挑取单菌落,转至深孔板中,用已灭菌的纱布或96孔板硅胶盖封住深孔板。将
96孔板固定在摇床上,37℃,900r/min培养过夜。按2%(体积分数)接种量转接至装有600μLLB
培养基的96深孔板,37℃,900r/min,~,向孔板中添加终浓度为1mmol/L
的IPTG,于28℃低温诱导6h。发酵结束后,对深孔板进行离心,向其中加入200μL溶菌酶(750
g/L)进行破碎,并加入400μL磷酸盐缓冲液进行稀释。使用DNS法来测定酶活性,直接在96孔板
中进行反应,用酶标仪批量测定540nm下的吸光值,DNS法测酶活性时,酶活性定义:,
55℃下,每分钟生成1μg葡萄糖还原当量的还原糖所需的酶量为1个酶活性单位。
将初筛得到的酶活性提高的突变体菌株接种于10mL含氨苄青霉素抗性的LB液体培养基中,
37℃、200r/min条件下培养过夜后,按2%接种量转接至200mL含氨苄青霉素抗性的LB液体培养
基中,37℃、200r/min条件下,~,加入IPTG(终浓度为1mmol/L),置
于28℃摇床中培养6h,在4℃、10000r/min下离心15min收集细胞,用磷酸盐(,浓度为
:.
徐寒冰等双果糖酐水解酶分子改造提升酶活性研究5
50mmol/L)缓冲液洗涤并悬浮,在冰水浴的条件下用超声破碎仪破碎细胞(300W,超1s,停2s,
破碎10min),破碎液在冰水浴条件下离心15min,取上清液用于后续的蛋白纯化。蛋白纯化采用
Ni-NTA柱亲和层析方法,用不同浓度的咪唑进行洗脱,收集各部分洗脱液。收集液进行SDS-PAGE
电泳,验证纯度。得到纯酶后,用HPLC法进行酶活性测定。
酶活性测定:酶促反应体系1mL包括10g/LDFA-III、100nmol/L纯酶液、50mmol/L磷酸盐缓
冲液(),反应温度55℃,反应时间为10min。沸水浴灭酶活性后,在10000r/min转速下,
离心10min,上清液过膜后进行HPLC检测。色谱柱:NH2P-504E氨基柱,流动相:65%乙***,流
速:1mL/min,柱温30℃,检测器:示差折光检测器。HPLC法测定时的酶活性定义为:在pH
,55℃下,每分钟生成1μmol菊二糖所需的酶量为一个单位酶活性U。
最适温度:分别在30~80℃(间隔5℃)下测定酶活性,把最适温度下的酶活性定义为100%,
计算其他温度下的相对酶活性。
最适pH:通过柠檬酸钠盐缓冲液(~)、磷酸盐缓冲液(~)、Tris-HCl缓冲
液(~)配制10g/L的DFA-Ⅲ底物,在最适温度条件下反应后测酶活性力,把最适pH下的
酶活性定为100%,计算其他pH下的相对酶活性。
动力学研究:100nmol/~50mmol/L的DFA-℃时反应
10min。反应后测定酶活性,根据双倒数法或者非线性拟合方法计算动力学参数。
将D380A氨基酸序列提交至SWISS-MODEL在线蛋白质模型构建服务器
(-)进行同源建模,模式选定为自动构建模式。选
定AcDFA-IIIase晶体结构(PDB登录号:5ZKS))作为模板进行三聚体结构的构建,模型的立体化
学质量主要是通过Wincoot软件的拉氏构象图来判定,而原子模型(3D)和氨基酸序列(1D)兼容
性的合理性是通过ASVES服务器的VERIFY-3D模块进行判定(/)。
最后使用可视化软件PyMOL对模拟结构进行展示和分析。
2结果与讨论
AcDFA-Ⅲase的晶体结构已经被解析出(PDBID:5ZKS),AcDFA-Ⅲase和底物双果糖酐复合
物的结构也被解析出(PDBID:5ZKU),AcDFA-Ⅲase是一个同源三聚体,活性口袋位于两个相邻
亚基形成的裂缝中,口袋中心的活性残基分为亲水和疏水残基两部分,亲水残基有Ser84,Tyr163,
Glu210,Arg258,Gln391,Asp177,Asp199,Gln222,Phe80,Ile85,Phe256以及Trp309。活性口
袋正上方存在一个具有重要调控作用的loop环(将其称为活性口袋上方的盖子,区域为
Asp378~Asp402)[18],loop区是蛋白最柔性部分,保守性低,选择这个区域的氨基酸残基可以避免改
变酶蛋白的保守结构,而且活性中心以及盖子周围的氨基酸残基对催化起重要作用[24-25]。所以最终选
择了这些区域的关键位点进行理性设计,例如Ala209位点是关键催化位点Glu210附近的残基,
Ser82在活性口袋里,以及Thr310在活性口袋且与盖子交界处,Val379,Asp380,Ala381,Phe388,
Ala397处于盖子区域,改变这些位点的残基有可能影响到酶的催化能力。
-Ⅲase突变文库的高通量筛选
DNS法是还原糖测定常用的经典方法,但应用传统方法对大批量样品检测仍较繁琐,所以有必
要建立微型化DNS法。本研究利用微孔板进行还原糖与DNS试剂反应,并用酶标仪测定540nm波
长下的吸光度,结果如图1所示,在96孔板中进行DNS法比色时,,
线性良好,能满足实验测定的需要。而且利用96孔板作为反应容器时,一块板可以同时处理96个样
品,样品处理完再利用移液排枪转移至酶标板,几分钟内即可读取数据,操作简便;另外在96孔板
中反应时,反应体系小,可节约试剂。所以微孔板结合DNS法检测有望成为酶活性高通量分析的方
:.
6食品与发酵工业
法。
将设计的突变体利用96孔板同步发酵培养,DFA-Ⅲase在大肠杆菌中是以胞内酶形式表达,利
用96孔板对菌体进行发酵培养时,尽量保持每个孔的菌体浓度一致,为了保持结果的重复性,将同
一样品的重组酶液分装在深孔板中,利用粗酶和底物反应,采用DNS法对水解物进行测定。结果如
图2所示,对原始AcDFA-Ⅲase进行定点突变得到的突变体酶仍然具有水解双果糖酐的能力,但是
大部分突变体的酶活性大幅度降低,只有D380A和C387A的酶活性有明显提高。利用此方法测出
D380A的酶活性是AcDFA-Ⅲ%,C3
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