甘草查尔酮B对人非小细胞肺癌A549细胞增殖和凋亡的影响.pdf

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·论著·
甘草查尔***B对人非小细胞肺癌A549细胞增殖和凋亡的影响
张芳红1朱公建1王晓敏2张永东1李海宁1朱小康1苏海翔1郭红云1
,甘肃兰州730050;,甘肃兰州730060
【摘要】目的:探讨甘草查尔***B(LCB)对于人非小细胞肺癌A549细胞增殖、周期及凋亡的影响。方法:采用CCK-8法和平板克
隆形成法检测LCB对A549细胞的增殖抑制作用;采用流式细胞技术检测对细胞周期、凋亡的影响;采用Westernblotting法检测线粒
体凋亡蛋白表达。结果:LCB可显著抑制A549细胞的增殖。LCB经处理后将A549细胞阻滞在G0/G1期(P<),同时细胞凋亡率也
明显增加(P<)。Bax/Bcl-2比值及Caspase-3蛋白表达明显上升(P<)。结论:LCB可通过阻滞细胞周期,诱导细胞凋亡,从而抑
制非小细胞肺癌A549的增殖。
【关键词】甘草查尔***B;非小细胞肺癌;人肺癌细胞株;A549;增殖;凋亡
【中图分类号】:A文章编号:1004-2725(2022)05-0385-05
TheeffectsoflicochalconeBoncellgrowthandapoptosisinA549non-smallcelllungcancercellsZhangFanghong1,ZhuGongjian1,
WangXiaomin2,ZhangYongdon1,LiHaining1,ZhuXiaokang6,SuHaixiang1,,
GansuProvincialCancerHospital,Lanzhou730050,China;’sHospital,Lanzhou730060,China
【Abstract】Objective:Toinvestigatetheeffectsoflicochalcone(LCB):The
inhibitsproliferationandinducesapoptosiseffectsofLCBinA549weredeterminedbyCCK-8assay,colonyformingassay,flowcytometry
:,thecell-cycle
wasarrestedatG0/G1(P<)andcellapoptosisratewasincreased(P<),Moreover,theBax/Bcl-2andtheproteinlevelsofCaspase3was
:WefoundthatLCBcaninhibitscellproliferationandinducesapoptosisinNSCLCA549cellsbycellcyclearrest.
【Keywords】licochalconeB;nonsmall-celllungcancer;humanNSCLCcell;A549;proliferation;apoptosis
肺癌的死亡率在中国居于恶性肿瘤之首,占恶性肿限公司),纯度98%,C16H14O5=。人肺癌细胞株
%,并且还在呈逐年上升的趋势[1]。A549由甘肃中医药大学高校重大疾病分子医学与中
许多药用植物中都含有黄***类化合物。由于黄***类化医药防治研究省级重点实验室惠赠。DMEM高糖培养
合物具有多种药效学功能,对人体的正常细胞毒性小,基(美国Hyclone公司),胎牛血清(美国CLARKBio-
但在杀伤肿瘤细胞方面显示出较强的作用,因此其抗science公司),CellCountingKit-8(CCK-8)试剂盒、BCA
癌活性研究已成为热点,是颇具应用前景的新抗肿瘤蛋白浓度测定试剂盒、SDS-PAGE凝胶制备试剂盒(均
药或抗肿瘤辅助药[2-3]。甘草查尔***B(licochalconeB,为北京Solarbio公司),AnnexinV-FITC/PI双染凋亡检
LCB)是从甘草中提取出来的重要黄***类化合物,具有测试剂盒(美国BD公司),鼠抗人GAPDH、Bcl-2单克
较好的抑菌消炎作用,在食品和化妆品领域也有广泛的隆抗体(美国Proteintech公司),兔抗人Bax多克隆抗
应用。既往研究发现,甘草查尔***B对多种肿瘤具有抑体(Immunoway,美国)、羊抗兔二抗、羊抗鼠二抗(Pro-
制作用,但甘草查尔***B对非小细胞肺癌细胞株的抑制teintech,美国),Western特异发光检测试剂盒(HRP)
作用还鲜有报道。本研究通过探讨甘草查尔***B对人肺(美国MilliPore公司)。
癌细胞株A549增殖和凋亡的影响及其可能的机制,(美国BD
肺癌的临床治疗提供参考依据。公司),ChemiDocTMXRSS+成像系统仪、XMarkTMMi-
1材料与方法croPlate酶标仪(美国Bio-Rad公司),MCO-20AIC-PC
细胞培养箱(日本Panasoni公司)。
(
。将细胞置于含10%胎牛血清、1%双
基金项目:甘肃省中医药管理局科研课题(编号:GZK-2016-42)
抗的DMEM高糖培养液,放入饱和湿度的培养箱中孵
第一作者:张芳红,女,副研究员,从事天然药物有效成分提取分离等研
究工作。E-mail:******@,温度37℃、5%CO2。当细胞处于对数生长期时可用
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于实验。内参,分析各目的蛋白的相对含量。
-8法检测增殖。%,数据以
长的细胞,轻轻吹打细胞制成单细胞悬液,计数,调整x±s表示,多组均数比较采用OneWayANOVA进行组间
细胞密度为5×104个/mL。取100μL细胞悬液加置96孔两两比较采用LSD法,P<。
板中。常规培养过夜使其贴壁后,弃上清,加入含有LCB
2结果
(终浓度分别为0、10、20、40、80、120μmol/L)的DMEM
高糖完全培养基200μL,作用24、48、72h后,
加入10μLCCK-8液,37℃孵育1h,波长450nm处测定的抑制A549细胞增殖,抑制作用随着剂量增大和时
吸光度值。每个浓度设4个平行孔,1个空白调零孔,间延长增强。LCB作用于A549细胞24h,其抑制率为
重复3次。计算增殖抑制率及半数抑制浓度(halfmaxi-%~%,;48h,抑制率为
malinhibitoryconcentration,IC50)。%~%,;72h,抑制率为
。%~%,。见图1。
胞数至250个/mL,接种2mL于直径35mm细胞培养皿
中过夜,加入LCB(终浓度0、10、20、40μmol/L)。置于
37℃,含5%CO2的培养箱中培养72h后,换无药培养
基继续培养10~14d。期间每3d换液1次,结束培养,
甲醇固定15min,结晶紫染液染色15~25min,流水冲洗
并室温放置干燥。计数克隆数,计算克隆形成率。
。
细胞悬液,将细胞接种于直径60mm细胞培养皿中
(×105个/皿),培养过夜使其贴壁后,弃去培养液,
加入含有LCB(终浓度0、10、20、40μmol/L)的培养基,
图1LCB对A549细胞增殖的影响
继续培养72h后,消化细胞,收集至离心管中,用预冷
PBS洗涤2次,滴加预冷75%乙醇,冰箱冷藏固定过夜。

重新1500rpm离心5min,弃上清,PBS清洗两遍,弃上
对照组的细胞克隆形成率(100±)%,20μmol/L、
清,每管分别加入180μLEDTA()、20μLRNase
40μmol/LLCB细胞克隆形成率分别为(±)%、
A(10mg/mL)、35μL2%TritonX-100、
(±)%,相对于对照组的细胞克隆形成率明显
(1mg/mL),4℃避光孵育10min。过滤,补加
200μLPBS混匀,用流式细胞仪检测细胞周期。实验重降低(P<)。见图2。
复3次。,
。(P<),可
和给药,培养72h后,消化收集细胞至离心管中,4℃PBS以将细胞阻滞在G1。10μmol/L、40μmol/L组均可使S
清洗2遍。加入1×BindingBuffer300μL悬浮细胞后,期细胞比例降低,与对照组比较,差异有统计学意义(P<
先后加入AnnexinV-FITC5μL,避光室温孵育15min,);20μmol/L、40μmol/L组G2/M细胞比例也明显降
再加入结合液400μL和PI5μL,避光孵育3min,1h内低(P<),10μmol/L剂量组G2/M细胞比例无明显变
上机检测细胞凋亡率。化(P>)。见图3。
。
加药培养48h后按试剂盒提取蛋白并进行定量。加入细胞72h,10μmol/L、20μmol/L和40μmol/L细胞总凋亡
上样缓冲液,并煮沸进行蛋白变性,SDS-PAGE电泳,率分别为:(±)%、(±)%和(±
半干转膜法将蛋白转至PVDE膜上,封闭2h,)%,对照组为(±)%;总凋亡的发生率均高
(GAPDH抗体1∶8000,Bax、Bcl2、Caspase抗体)于4℃于对照组(P<),并且随着LCB浓度增加,凋亡率也
均1∶1000)4℃孵育过夜,TBST缓冲液洗膜5次后,再随之上升。LCB干预A549细胞72h,10μmol/L、20μmol/L
用二抗(1∶8000),继续洗5次,ECL显和40μmol/L细胞凋亡率均高于对照组(P<),并且
色液显色后于凝胶成像系统曝光成像,并以GAPDH为随着LCB浓度增加,凋亡率随之上升。见图4。
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ControlLCB10μmol/LB
注:A为LCB作用48h后流式峰图;B条形图显示周期不同阶段的百分比
(与control比较,aP<,与10μmol比较,bP<;与20μmol比较,cP<)
图3LCB对A549细胞周期的影响
ALCB20μmol/LLCB40μmol/L
ControlLCB10μmol/L
B
注:A为结晶紫染***;B为克隆形成率柱状图(与control比较,aP<
ALCB20μmol/LLCB40μmol/L
图2LCB对A549细胞平板克隆形成的影响
B
注:A为细胞凋亡流式散点图;B柱状图显示细胞凋亡率(与control比
ControlLCB10μmol/L较,aP<,与10μmol比较,bP<;与20μmol比较,cP<)
图4LCB对A549细胞凋亡的影响
、Bcl-2和Caspase-3蛋白表达影响
A549细胞经药物干预48h,LCB各剂量组Bax蛋白表
达升高,而Bcl-2蛋白表达降低,Bax/Bcl-2比值升
高,与对照组比较均有统计学差异(P<)。LCB各
剂量组干预A549细胞48h,Caspase-3蛋白表达量随
剂量上升而增加,20μmol/L和40μmol/L剂量组与对
ALCB20μmol/LLCB40μmol/L照比较有统计学差异(P<)。见图5。
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除体内多余或受损的细胞,是一种精确的细胞分裂和
细胞死亡之间的动态平衡。但细胞分化异常、凋亡受到
抑制、细胞增殖失控均会造成肿瘤的无限生长。凋亡相
关基因表达异常、突变或缺失,可以阻断细胞的凋亡,
打破细胞分裂和细胞死亡的平衡,促进肿瘤的发生发
展[13-14]。细胞线粒体途径凋亡的激活与外膜的通透性
密切相关,当细胞受到某种程度的影响时,促凋亡基因
A就会从膜间隙转运到胞质中,进而启动Caspase级联
反应,诱发凋亡现象,而线粒体外膜的通透程度是由
Bcl-2家族内部多种蛋白相互调控决定。Bcl-2家族在
调控线粒体介导的凋亡途径中十分关键,其中比较重
要的有抑制凋亡的Bcl-2和促进凋亡的Bax,二者之间
的相互平衡决定了生物体内细胞的存活与死亡[15-16]。
Caspase蛋白酶家族是许多介导凋亡途径的最终聚集
点,而Caspase-3为整个凋亡途径中的核心蛋白之一,
B是凋亡的执行者和关键酶,可与Caspase-8酶原和Cas-
pase-9前体蛋白相互结合,触发相应的凋亡顺序活化[17]。
本研究采用AnnexinV-FITC/PI双染法检测LCB
对A549细胞凋亡的影响。结果显示,随着LCB浓度的
增加和时间延长,细胞凋亡率明显增加,提示LCB诱
导A549细胞凋亡呈浓度和时间依赖性。蛋白免疫印
迹法进行定量检测,结果显示LCB可以上调Bax/Bcl-2
C
注:A蛋白电泳图;B为柱状图显示Caspase3蛋白水平的相对表达及Caspase-3的表达,从而推测LCB对A549细胞的增
量;C柱状图显示Bax、Bcl-2蛋白水平的相对表达量(与control相比,殖抑制作用可能是通过介导线粒体途径细胞凋亡来实
aP<,与10μmol相比,bP<)现的。但LCB对A549细胞凋亡上游的受体及其他通
图5LCB对A549细胞BAX、Bcl-2及Caspase-3路的影响,有待进一步深入探讨。
蛋白表达的影响
参考文献
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段的出现为患者带来了希望,但对于无靶点和出现耐modelforpulmonarythromboembolisminpatientsundergoinglung
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药的患者化疗仍然是最常用的临床治疗方案。
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期检测,显示LCB能显著抑制非小细胞肺癌A549细胞
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的增殖,且抑制程度随LCB浓度的增加而增加。inducesaPoPtosisofhumannon-small-celllungcancercellsbydual
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(下转第422页)
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治则治法,这些为中医药治疗肝癌提供了证据支持。但和生存质量的影响[D].兰州:甘肃中医药大学,2016.
由于限于文献数量及研究时效性,本研究纳入的文献数[6]鲁维德,刘晓东,王兴东,
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量相对偏少,文献覆盖不够全面,名家经验、实验研究
[7][D].
尚未纳入到本次研究中,下一步将扩大文献量,结合共兰州:甘肃中医药大学,2019.
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