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454测序
第二代测序技术(Next-Generation Sequencing)
NGS之基础篇
2001年,美、英、法、德、日、中六国合作,历时十年,耗资数十亿美元的人类基因组计划(Human Genome Project,HGP)宣告完成。转眼又是十年过去,在此期间,各国科学家仍在为解读基因的密码而不懈努力,这其中最大的突破,就是第二代测序技术的推出。HGP的顺利完成证明了我们有能力对自身的遗传信息进行研究,然而,高昂的成本、漫长的时间、巨大的人力需求,无不限制着对遗传密码的进一步认识。从HGP开始的第一天期,科学家们就在寻求更好的方法来对基因组进行研究,“鸟枪法”就是其中之一。2006年,美国X大奖基金会(奖金高达1000万美元的基因组Archon X大奖,旨在奖励第一个在10天内以低于100万美元的成本完成100个人类基因组测序的民间团队。而罗氏(Roche)、应用生物系统(Applied Biosystems,ABI)、Illumina三家公司先后推出了各自的第二代高通量测序平台,成为NGS领域的领头羊。
2005年底,454公司推出第一个基于焦磷酸测序原理的高通量基因组测序系统——Genome Sequencer 20 System,这是核酸测序技术发展史上里程碑式的事件。随后,,并在2006年推出了更新的GS FLX测序系统,该系统可在10小时的运行中获得100万条读长(reads),4~6亿个碱基信息(base pair),且准确率达到
99%以上。2008年,GS FLX系统再次升级,通量提高了5倍,读长和准确率也有所增加。虽然454 GS测序平台也许不是市场占有率最高的测序仪,但截至2011年3月,利用该系统进行研究的论文已发表超过1000余篇,而它在读长上的优势明显胜于另两套系统,因此在从头测序(de novo)和宏基因组测序(meta genome)方面有着不可替代的地位。
2006年,Solexa公司也推出了自己的NGS系统——Genome Analyzer,简称GA。这套基于DNA簇(DNA cluster)、桥式PCR(Bridge PCR)和可逆阻断(Reversible terminator)等核心技术的系统具有高通量、低错误率、低成本、
应用范围广等优点。2007年,Illumina公司以6亿美元的高价收购了Solexa,使GA得以商品化。GA最早期的版本一次运行可获得1Gb的数据,因此也有1Gb Analyzer的含义,而最新的Hiseq2000平台则能够在10天的运行中获得300Gb以上的数据,读取的碱基长度达到150bp左右。更有消息称,Illumina已完成了600Gb的运行测试并在部分客户中开展了前期体验,Tb(1000Gb)级的测试Run也将于年内进行。据不完全统计,Illumina公司已售出超过600台/套GA IIx和Hiseq2000平台,2010年仅深圳华大基因研究院一家就购买了128台Hiseq2000,一举成为全球最大的基因组测序与分析中心,Illumina公司在测序领域的影响力由此可见一斑。
在Sanger测序时代,美国应用生物系统公司(ABI)一直是该行业的龙头老大,其垄断地位无人能撼,从早期的377到全自动化的3730xl,ABI的测序仪被广泛应用在基因组学研究的各个方面。然而在第二代测序技术迅猛发展之初,
ABI起步较晚,显得有些漫不经心。直到2005年454公司推出GS平台,ABI的领先地位受到威胁,这才开始发力,迅速收购了研发NGS的一家小公司Agencourt,并于2007年推出了它的SOLiD测序平台。此后SOLiD不断升级,目前已到SOLiD 5版本(SOLiD 5500xl)。SOLiD的全称是Sequencing by Oligo Ligation Detection,即寡聚物连接检测测序,其基本原理是通过荧光标记的8碱基单链DNA探针与模板配对连接,发出不同的荧光信号,从而读取目标序列的碱基排列顺序。在该方法下,目标序列的所有碱基都被读取了两遍,因此SOLiD最大的优势就是它的高准确率。据悉,SOLiD 5平台的测序通量已达到30Gb/天,成本低于60美元/Gb,%。并且由于SOLiD系统采用的不是PCR反应进行DNA合成与测序,因此对于高GC含量的样本,SOLiD系统具有非常大的优势。
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NGS之进阶篇
以下图片:1. 454 GS FL