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专利名称:使用nm23的细胞培养,包含nm23的细胞培养基和在nm23存在下培养的细胞的治疗性用途的制作方法
技术领域:
本发明涉及制备用于治疗性应用的生物细胞的方法,以及使用生物细胞的治疗的方法,和包含适合于治疗性应用的生物细胞的药物。本发明还提供用在生物细胞的培养中,特别是用于维持培养物中未分化的生物细胞的方法和培养基。治疗性应用或待培养的生物细胞可以优选地是干细胞或祖细胞。
在越来越多的情况中,认识到生物细胞可以被治疗性地应用。也许包括生物细胞的应用的疗法的最佳已知例子是i)基因疗法,其中生物细胞被修饰从而表达治疗基因产物,并且被修饰的细胞被施用于需要治疗的受试者;ii)干细胞疗法,其中当细胞被施用于需要治疗的受试者时将干细胞或祖细胞的多能性质用于产生治疗效应(例如,通过形成新的组织,其可以取代或加强受试者中受损或异常的组织)和iii)免疫疗法,其中生物细胞的免疫活性性质被修饰从而产生治疗效应,并且被修饰的细胞被施用于需要治疗的受试者。
在上述实例的每个中,生物细胞可以是或衍生自,分离自接受治疗的受试者的细胞。在这些情形中,治疗基于使用自体细胞从而获得治疗效应。
在基于生物细胞的疗法中的进展产生了对于在它们的治疗性应用前可以在活体外(exvivo)维持生物细胞的技术的需要。使用现存技术,干细胞或祖细胞的培养特别存在问题。目前的技术利用添加了血清,或细胞因子诸如白细胞介素-3(IL-3),白细胞介素-11(IL-11),干细胞生长因子(SCF)和Flt-3配体的培养基的活性,从而促进干细胞或祖细胞在活体外的增殖。然而,这些现存的技术具有许多局限,特别是在它们在充足时间内维持生物细胞以容许它们的治疗性适用而不会诱导细胞成熟和分化的能力方面。出于多方面原因,维持干细胞或祖细胞而不会导致细胞的成熟或分化的能力是在使利用生物细胞的疗法的有效性最大化中是最重要的。
首先,在干细胞疗法的情形中,适用的细胞的治疗效应依赖于它们的多能性质,这容许细胞在需要治疗的受试者中产生替代组织。如果待用于治疗的细胞在培养的过程中经过了未受控制的分化,则它们可以形成的可能谱系的数量会减少,而且因此它们最终的治疗潜能也会降低。
第二,在其它的治疗背景下,可能理想的是在它们施用于需要治疗的受试者之前,诱导生物细胞被控制分化成为需要的细胞类型。这些受控的分化容许细胞被操控从而产生具有最大的治疗价值的所需细胞类型,并且协助适用细胞随后靶向需要治疗活性的组织。现存技术,其中分化没有以专业人员的方向发生,而是在存在与血清中的细胞因子的
“混合物”或细胞因子添加培养基的未受控制的作用下,这阻止了所需的细胞谱系的有目的的产生并且可以导致混合的细胞群的产生,并由此减少治疗效力。
到目前为止,没有现有技术持续足够成功来容许它们在基于生物细胞的疗法中的广泛临床应用。因此,存在对于开发制备用于治疗性应用的生物细胞的改善的方法,和使用生物细胞的治疗的改善的方法的需要。
此外,还将理解的是根据上述,存在对于开发能够促进生物细胞生长而不会导致成熟和/或分化的新的或改善的细胞培养方法,条件和培养基的需要。这些新的或改善的细胞培养源可以不仅用在干细胞和/或祖细胞的治疗性适用中,还可以用在生物细胞(特别是干细胞和/或祖细胞)的培养中从而用于研究和/或开发目的。尽管理想的是能够培养这些细胞(例如,容许细胞数量的扩大而不成熟或分化),通常现有技术中的技术人员可获得的适合的资源是缺乏的。
按照本发明的第一个方面,存在提供制备用于治疗性应用的生物细胞的方法,所述方法包括连续或并行的步骤i)在存在NM23蛋白质的情况下,培养生物细胞;和ii)使所述生物细胞适用于治疗性应用。
按照本发明的第二个方面,提供治疗方法,所述方法包括连续或并行的步骤i)获得生物细胞;ii)在存在NM23蛋白质的情况下,培养生物细胞;和
iii)使所述生物细胞适用于治疗性应用并且还包括将适用的生物细胞施用给需要这种治疗的受试者。
所述NM23基因家族包括8个人类成员,被称为NM23-H1到NM23-H8,其编码NM23蛋白质的8个不同同工型。已经报道NM23-H1蛋白质和NM23-H2蛋白质具有88%的同源性,并且NM23-H3蛋白质与NM23-H1和NM23-H2蛋白质具有70%的同源性。在其它哺乳动物物种中,还存在已知的同系物,诸如NM23-H1的哺乳动物同系物NM23-M1。本发明一般涉及使用NM23蛋白质,但是优选地涉及使用人NM23蛋白质,并且最优选涉及使用NM23-H1蛋白质。
NM23-,。%的同源性,优选地可以具有至少70%的同源性。更优选地,%的同源性,甚至更优选地具有至少90%的同源性,并且最优选地具有至少95%的同源性。尽管优选使用与NM23-H1具有同源性的NM23蛋白质,将理解的是在选择适合的试剂以按照本发明的应用中最重要的因子之一是与NM-23共有的序列同一性的程度。因此,%的同一性,尽管优选的试剂可以具有至少
70%的同一性,更优选地具有80%的序列同一性,甚至更优选地具有至少90%的序列同一性,并且最优选地具有至少95%的序列同一性。
从在前的段落中将理解的是,本发明不仅涉及NM23蛋白质的野生型同工型,还涉及能够发挥与野生型同工型相同的生物作用的这些蛋白质的突变形式,片段,衍生物和类似物。这些突变蛋白质,片段衍生物和类似物可以来自任何物种的NM23的蛋白质,但是优选地来自哺乳动物NM23蛋白质,更优选来自人NM23的蛋白质,最优选来自NM23-H1。适合于按照本发明使用的突变蛋白质,蛋白质片段,衍生物和类似物可以优选地比野生型蛋白质更具有生物学活性,和/或对降解更具有抗性。因此,突变蛋白质,蛋白质片段,蛋白质衍生物和类似物可以优选地具有对于培养细胞的更大的生物利用率,和确实可以在培养条件下具有延长的半寿期。
本发明者已经令人惊讶地发现使其适合于按照本发明的各个方面使用的NM23的有益作用也能够跨越物种界线发挥。特别地,本发明人已经发现人NM23蛋白质(诸如重组人NM23-H1)能够在鼠细胞的培养物中产生有利的生物作用。即使当使用人NM23蛋白质时,技术人员将立即理解这种令人惊讶的发现表明本发明的应用方法和细胞培养基适合于用在其中生长非人细胞的应用(除了治疗性应用)中。通过实例的方式,啮齿类动物的细胞的培养物代表了用在研究和开发应用的范围中的常用工具,并且将理解的是,这些培养物可以从来自人和其它非
-啮齿类动物物种中的NM23蛋白质的使用中获益。等同地,人细胞的培养物也可以从来自非人来源的NM23蛋白质的添加中获益。
本发明基于本发明人的发现,即,NM23蛋白质能够作为培养细胞的存活因子发挥功能,也能作为能够预防细胞分化和成熟的试剂发挥功能。因此,在本发明的第三个方面,提供了使用NM23蛋白质来在培养物中维持未分化的生物细胞。
在本发明的另一个方面,还提供了将NM23蛋白质用作存活因子,并且在另一个方面,提供将NM23蛋白质用于预防培养的生物细胞的分化和成熟。
考虑到它们作为存活因子的活性和预防细胞分化和成熟的能力,技术人员将理解NM23蛋白质大大有利于将被适用于治疗性应用中的细胞的培养,因为在存在NM23的情况下培养细胞保持最大可能的治疗效力。NM23蛋白质也用在用于非治疗性目的的生物细胞的培养中,因为这些蛋白质的相同的生物学作用也在广泛的非治疗性目的,包括(但不限于)研究和开发应用所采用的细胞培养物中具有应用。
本发明人已经发现NM23蛋白质能够在已经经过深低温保藏的细胞上施加它们的有益影响,并且认识到这种益处提供了许多优势。例如,了解到深低温保藏的冻融细胞的过程与这样保藏的细胞中的某种程度的死亡有关。在进行深低温保藏的小细胞种群中,这种细胞损失可具有特别不利的后果,因为损失的细胞数量可能经常代表实际上有相对更大比例的存在的细胞总数的细胞损失。这些小细胞种群的典型实例可以包括临床或其它治疗样品,其中仅有相对小量的细胞可以通过可用的收集方法而获得。
技术人员还将理解深低温保藏代表这样的常规技术,其用在预定为不管是用于治疗性目的还是非治疗性目的施用的干细胞和/或祖细胞的贮藏和/或运输中,并且本发明的各个方面用于“存档”深低温保藏原种(即,现存的治疗性或非治疗性细胞的原种)中的适用性也是特别有利的。
常规现有技术依赖于将多种细胞因子的“混合物”用于在活体外促进干细胞或祖细胞的增殖中。细胞因子典型地作为血清添加物的部分或除此之外进行提供。准备用在干细胞群的增殖中的商购培养基包括因子诸如白细胞介素-3和白细胞介素-11(IL-3和IL-11),干细胞生长因子和Flt-3配体。这些细胞因子的存在,尽管有助于促进细胞分裂,却导致了培养细胞的成熟和分化。这种成熟超出了专业人员的控制,并且代表了主要的不利方面,因为其减少了细胞可以最终形成的不同细胞谱系的数量并且可能阻止细胞受控制分化成优选的细胞类型。
与现有技术形成对比,本发明人已经发现用NM23蛋白质添加细胞培养基促进了细胞存活而不伴随分化,并且不需要提供血清或外源生长因子。在存在
NM23蛋白质情况下培养并且适用于治疗性应用的多能细胞在治疗中特别有益,因为它们保持了它们形成广泛范围的细胞类型的能力(即,保持它们的多能特性)。按照这种发现,将理解的是,在本发明的优选实施方式中,细胞在存在NM23蛋白质,并且培养基中缺乏其它细胞因子或血清的情况下进行培养。在NM23蛋白质用于无血清或无细胞因子条件的这种应用中,NM23的主要功能可能是给培养细胞提供存活信号。
在本发明的另一个方面中,提供了添加了NM23蛋白质的培养基以促进培养物中的细胞存活而不伴随分化。本发明还涵盖了被配制用作培养基的添加物的NM23蛋白质。该培养基可以优选地是无血清培养基和/或无细胞因子培养基。
在本发明的备选优选实施方式中,可以将NM23的添加和其它细胞培养添加物组合使用,所述其它细胞培养添加物诸如血清,或细胞因子(其可以,例如,包括这样的试剂诸如白细胞介素-3,白细胞介素-6,血小板生成素,Flt-3配体和/或干细胞生长因子)。在这样的实施方式中,本发明人认为NM23蛋白质可能用于,响应添加的细胞因子的活性,提高培养细胞的增殖(即,NM23可以用于响应已知细胞因子添加方式增进增殖)。因此,可以选择添加的细胞因子提供增殖刺激的能力,否则,所述增殖刺激可能在存在NM23蛋白质的情况下在培养的细胞中缺乏。本发明人还认为NM23蛋白质可以发挥作用阻止培养细胞的分化,而这种分化在其它情况下在响应于添加的细胞因子的信号时可能发生
(即,添加了NM23蛋白质的培养条件可以用于刺激细胞增殖,同时抑制由已知细胞因子添加方式提供的分化和/或成熟信号)。
在遵循上述的作用方式中,本发明人已经发现NM23的添加容许干细胞群在培养物中扩增,所述培养物使用比前面所用的细胞因子混合物要简单(例如,增殖可以在单独存在白细胞介素-3和干细胞生长因子的情况下实现)。可以预计这些相对更简单的细胞因子混合物给这样培养的细胞提供减少的分化刺激。此外,本发明人已经发现用NM23蛋白质进行添加增加了在干细胞和/或祖细胞群中发生的“自我更新”分裂的数量。这些自我更新的分裂组成干细胞活性和种群的确定特性,并且增加这些分裂发生的数量的能力在维持和/或增加干细胞和/或祖细胞在培养的细胞种群中的数量的方面是有利的,在所述自我更新分裂中,分裂细胞形成子细胞,其中一个子代保持与母细胞相同的成熟状态。
本发明人已经发现NM23添加的有益效果可以通过持续暴露于NM23蛋白质直到已经成功获得所需的生物学结果(例如,本文考虑的细胞种群扩增或其它有利效应)而获得。或者,该有益效果还可以通过将干细胞和/或祖细胞早期暴露于NM23,例如在随后的移去NM23添加物之前的第1,第2,第5,第10或第15天培养中。
优选的是可以将NM23蛋白质提供为细胞外蛋白质,例如作为细胞(或组织)培养基的添加物。提供的NM23蛋白质可以是外源的或重组的蛋白质。如果NM23蛋白质将在细胞培养基中进行提供,,,,。
适当地,提供作为被培养细胞的细胞外蛋白质的NM23蛋白质可以通过已知技术产生。例如,该蛋白质可以纯化自NM23蛋白质的天然存在来源。当然,可以诱导NM23蛋白质的这些天然存在来源以表达提高水平的蛋白质,所述蛋白质接着可以使用众所周知的常规技术进行纯化。或者,可以诱导不天然表达NM23蛋白质的细胞来表达这些蛋白质。一个适合的技术包括NM23蛋白质/his构建体的细胞表达。被表达的构建体随后可以通过其his标记被高度纯化。
或者,按照本发明培养的细胞可以被诱导以过量表达NM23蛋白质。这种效果可以通过操控内源NM23蛋白质表达,或导致培养的细胞表达外源NM23蛋白质来获得。可以通过用众所周知的载体转化细胞来诱导外源NM23蛋白质的表达,可以将编码NM23蛋白质的cDNA插入所述载体中。可以优选的是由培养的细胞瞬时表达外源NM23蛋白质(例如,这种情况,即,表达仅在活体外培养过程中发生并在将所述细胞施用给需要治疗的受试者后停止