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使ACC-α基因启动子PⅢ失活的物质及其应用的制作方法
本发明公开了使ACC-α基因启动子PⅢ失活的物质在生产产低脂奶的奶牛中的应用。本发明首先保护一种蛋白组,由TALE蛋白甲-Ⅰ和TALE蛋白甲-Ⅱ组成;所述TALE蛋白甲-Ⅰ包括序列表的序列14自N末端第180-791位氨基酸残基组成的结合域和序列表的序列14第867-1062位氨基酸残基组成的功能域;所述TALE蛋白甲-Ⅱ包括序列表的序列15自N末端第190-733位氨基酸残基组成的结合域和序列表的序列15自N末端第809-1004位氨基酸残基组成的功能域。本发明发现了可以高效沉默ACC-α基因启动子的靶点,并基于该靶点设计了蛋白组、基因组、质粒组和RNA组,可以成功沉默了ACC-α基因启动子,且敲除效率非常高。
【专利说明】使ACC-α基因启动子PIII失活的物质及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及使ACC-α基因启动子PIII失活的物质及其应用。
【背景技术】
[0002]基因打靶技术是一种定向改变生物体遗传信息的技术,但对于动物体细胞的打靶效率很低(仅为10_6-10_7)。伴随着分子生物学的不断发展,涌现出很多新的技术和方法来提高基因打靶效率,如采用无启动子筛选的基
因打靶策略,动物中干细胞的分离及诱导等,但是这些改进对于生产基因打靶动物并没有显著的推动作用,基因打靶动物的生产一直处于缓慢发展阶段。最近几年,类转录激活因子效应物核酸酶(TALENs)的出现极大地提高了基因打靶的效率,其将成为生产基因敲除动物的一个重要突破口。
[0003]类转录激活因子效应物核酸酶(TALENs)融合了DNA调控元件特异性结合DNA的特性以及内切核酸酶的催化活性,N末端的TALE蛋白结合域能够特异结合DNA序列,通过C末端内切核酸酶FokI的催化作用,使得DNA双链分子产生断裂(DSB),紧接着DSB就会启动细胞内自身修复机制。目前主要的修复机制有两种:一种是非同源重组的末端连接修复机制,另一种是同源重组修复机制。前一种修复机制是一种易错修复常常会产生遗传信息的改变,而利用同源重组修复机制来修复DSB是一种高保真的修复方式,一般以另一条姐妹染色体为模板进行精确修复。在哺乳动物细胞内,前一种修复机制占主导作用,借助TALENs特异性产生DSB,引发细胞非同源重组的末端连接修复,在DSB位点引入小片段删除或插入,造成移码突变,或者引发失活突变等,达到使目的基因失活的目的。该技术的关键在于靶点区域的选择。
[0004]随着人们生活水平的提高,对健康优质奶品的要求也越来越高,人们更加关注牛奶中的优质蛋白质,同时希望牛奶中所含的脂肪更少。对于目前市场上的脱脂牛奶来说,在脱脂的过程中脂溶性的维生素也会被除去,主要是维生素
A和维生素D,影响了人体对钙质的吸收,而且如果完全脱掉牛奶中的脂肪,会破坏其营养价值,影响牛奶的口感和风味。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是提供使ACC-α基因启动子PIII失活的物质在生产产低脂奶的奶牛中的应用。
[0006]本发明首先保护一种蛋白组,由TALE蛋白甲-1和TALE蛋白甲_II组成;所述TALE蛋白甲-1包括序列表的序列14自N末端第180-791位氨基酸残基组成的结合域和序列表的序列14第867-1062位氨基酸残基组成的功能域;所述TALE蛋白甲-1I包括序列表的序列15自N末端第190-733位氨基酸残基组成的结合域和序列表的序列15自N末端第809-1004位氨基酸残基组成的功能域。所述TALE蛋白甲-1具体可如序列表的序列14所示。所述TALE蛋白甲-1I具体可如序列表的序列15所示。所述TALE蛋白甲-1和所述TALE蛋白甲-1I具体可等质量配比。
[0007]本发明还保护一种DNA组,由TALE基因甲-1和TALE基因甲-1I组成;所述TALE基因甲-1编码所述TALE蛋白甲-1;所述TALE基因甲-1I编码所述TALE蛋白甲-1I。所述TALE基因甲-1包括序列表的序列10自5’末端第548-2383位核苷酸所示的结合域编码区和序列表的序列10自5’末端第
2609-3199位核苷酸所示的功能域编码区。所述TALE基因甲-1I包括序列表的序列11自5’末端第578-2209位核苷酸所示的结合域编码区和序列表的序列11自5’末端,第2435-3025位核苷酸所示的功能域编码区。所述TALE基因甲-1具体可如序列表的序列10所示。所述TALE基因甲-1I具体可如序列表的序列
11所示。所述TALE基因甲-1和所述TALE基因甲-1I具体可等质量配比。
[0008]本发明还保护一种RNA组,由TALE-RNA甲-1和TALE-RNA甲-1I组成;所述TALE-RNA甲-1为所述TALE基因甲-1编码的RNA;所述TALE-RNA甲-1I为所述TALE基因甲-1I编码的RNA。所述TALE-RNA甲-1和所述TALE-RNA甲-1I具体可等质量配比。
[0009]本发明还保护一种质粒组,由质粒甲和质粒乙组成;所述质粒甲为含有所述TALE基因甲-1的质粒;所述质粒乙为含有所述TALE基因甲-1I的质粒。所述质粒甲和所述质粒乙具体可等质量配比。所述质粒甲具体可为将序列表的序列6所示的TALE基因片段甲-1插入pCS2-FokI载体(PEAS型)的NheI酶切位点得到的重组质粒TALENs_2201L。所述质粒乙具体可为将序列表的序列7所示的TALE基因片段甲-1I插入pCS2-FokI载体(PERR型)的NheI酶切位点得到的重组质粒TALENs_2201R。
[0010]本发明还保护以上任一所述蛋白组、以上任一所述所述DNA组、以上任一所述所述RNA组或以上任一所述所述质粒组的应用,为如下(a)、(b)或(c):Ca)使ACC-α基因启动子PIII失活;(b)制备使ACC-α基因启动子PIII失活的试剂盒;(C)沉默离体的牛胎儿成纤维细胞中的ACC-α基因启动子PIII。所述ACC-a基因启动子PIII具体可如序列表的序列I所示。
[0011]本发明还保护将所述TALE-RNA甲-1和所述TALE-RNA甲-1I导入离体的牛胎儿成纤维细胞得到的ACC-α基因启动子PIII失活的重组细胞。所述ACC-α基因启动子PIII具体可如序列表的序列I所示。
[0012]本发明还保护以上任一所述蛋白组、以上任一所述所述DNA组、以上任一所述所述RNA组、以上任一所述所述质粒组或以上任一所述重组细胞在制备试剂盒中的应用;所述试剂盒的功能为生产产低脂奶的奶牛。
[0013]乙酰辅酶A羧化酶a(ACC-a)是脂肪酸从头合成的限速酶。ACC-α基因由三个不同启动子驱动。在乳腺中,由启动子PI驱动的ACC-α表达量始终保持总量的约33%,启动子PII驱动的ACC-a表达量在牛的乳腺中也不受泌乳期的影响,PIII是ACC-α的三个启动子中唯一在泌乳期于乳腺上皮细胞中被强烈诱导的启动子(约28倍)。
[0014]在类转录激活因子效应物核酸酶(TALENs)技术的基础上,本发明中发现了可以高效沉默
ACC-α基因启动子的靶点,并基于该靶点设计了蛋白组、基因组、质粒组和RNA组。本发明中将RNA组导入牛成纤维细胞,成功沉默了ACC-a基因启动子,且敲除效率非常高,为生产基因敲除动物提供了极大的便利。
[0015]常规基因打靶克隆牛的生产流程,包括构建基因打靶载体、载体转染、细胞药物筛选、细胞单克隆的鉴定、体细胞核移植、克隆牛的鉴定。完成上述过程需要的时间为:载体构建3个月,细胞筛选I个月,体细胞核移植、胚胎发育I个月,胚胎移植妊娠到小牛出生10个月。这样,一次克隆至少需要14个月的时间。最后得到的克隆牛含有药物筛选所必须的抗性基因,要得到不含抗性基因的动物个体还要经历一次体细胞克隆。本发明中将RNA组导入牛成纤维细胞,再将重组细胞与吸弃染色体的牛卵母细胞融合,然后将重构胚移入受体母牛的子宫,12个月即可得到基因敲除且不含抗性基因的克隆牛。本发明中通过一次转染即可得到基因敲除的细胞克隆,这在常规基因打靶过程中是难以实现的,省去了药物筛选过程,有利于细胞单克隆的形成,避免了细胞需要对抗药物毒害的过程,对于后续的体细胞核移植和胚胎发育质量起到了关键作用,同时不含有抗性基因,大大简化了生物安全评价过程。本发明中用于转染的遗传物质为mRNA,在细胞内的半衰期约为8小时,不会存在转DNA时随机插入细胞基因组的情况,对于动物遗传稳定性有良好的保证。同时不会有抗性基因的随机整合,符合生物安全方面的要求。
[0016]本发明中得到的克隆牛,由于ACC-α基因启动子失活,理论上能特异性减弱泌乳期ACC-α基因在乳腺上皮细胞中的表达量,使长链脂肪酸的合成量减少,从而降低牛奶中的脂肪含量,无需再进行脱脂(避免损失维生素),可以大大满足人们日益增长的对健康优质奶品需求。
【专利附图】
【附图说明】
[0017]图1为pCS2_FokI载体的结构示意图。
[0018]图2为实施例2中的部分测序结果。
[0019]图3为实施例3中的部分测序结果。
【具体实施方式】[0020]以下的实施例便于更好地理解本发明,但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法,如无特殊说明,均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料,如无特殊说明,均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验,均设置三次重复实验,结果取平均值。
[0021]取40日龄荷斯坦奶牛胎儿耳组织,按照常规方法[《细胞实验指南》(上册),【美】;黄培堂等译。北京:科学出版社,;第一章,第4节,27-32页.]制备得到牛胎儿成纤维细胞系。
[0022]pCS2-FokI载体(TALENs骨架载体)的结构示意图见图
1。pCS2_FokI载体:CffBIO;包括一对结构基本相同的质粒,pCS2-FokI载体(PEAS型)和pCS2_FokI载体(PERR型)。pCS2-FokI载体(PEAS型)又称PEAS型pCS2_FokI载体,pCS2_FokI载体(PERR型)又称PERR型pCS2-FokI载体。pCS2_FokI载体(PEAS型)和pCS2_FokI载体(PERR型)的差异仅在于:pCS2-FokI载体(PEAS型)具有编码FokI核酸内切酶(PEAS型)的DNA序列,pCS2-FokI载体(PERR型)具有编码FokI核酸内切酶(PERR型)的DNA序列。FokI核酸内切酶(PEAS型)和FokI核酸内切酶(PERR型)形成2聚体后发挥内切酶的功倉泛。
[0023]实施例1、TALENs表达载体的构建
[0024]一、筛选靶点区域
[0025]基于大量分析筛选与验证,确认将ACC-α基因的启动子PIII(ACC-α基因的启动子PIII如序列表的序列I所示)中的两个区域作为靶点:[0026]靶点区域甲如下:
[0027]5’-tGTGTACTTCTGTTTTGAAGggttttcgtggaatgtTAATAGATTCGCGGCATa-3’;
[0028]靶点区域甲中,左侧的下划线为TALE蛋白甲-1的识别域,右侧的下划线为TALE蛋白甲-1I的识别域的反向互补序列,中间为FokI内切核酸酶切割位点。
[0029]靶点区域乙如下:
[0030]5,-tTTGTGTACTTCTGTTTTGAagggttttcgtggaaTGTTAATAGATTCGCGGCa-3’。
[0031]靶点区域乙中,左侧的下划线为TALE蛋白乙-1的识别域,右侧的下划线为TALE蛋白乙-1I的识别域的反向互补序列,中间为FokI内切核酸酶切割位点。
[0032]二、设计TALE蛋白
[0033]基于靶点区域甲,设计一对TALE蛋白(由TALE蛋白甲-1和TALE蛋白甲-1I组成XTALE蛋白甲-1的结合域如序列表的序列2所示(识别18个核苷酸),TALE蛋白甲-1I的结合域如序列表的序列3所示(识别16个核苷酸)。
[0034]基于靶点区域乙,设计一对TALE蛋白(由TALE蛋白乙-1和TALE蛋白乙-1I组成)。TALE蛋白乙-1的结合域如序列表的序列4所示(识别18个核苷酸),TALE蛋白乙-1I的结合域如序列表的序列5所示(识别17个核苷酸)。
[0035]三、制备DNA分子
[0036]制备用于编码TALE蛋白甲-1的结合域的DNA分子和用于编码TALE蛋白甲-1I的结合域的DNA分子。用于编码TALE蛋白甲-1的结合域的DNA分子为TALE基因片段甲-1(如序列表的序列6所示),用于编码TALE蛋白甲-1I的结合域的DNA分子为TALE基因片段甲-1I(如序列表的序列7所示)。
[0037]制备用于编码TALE蛋白乙-1的结合域的DNA分子和用于编码TALE蛋白乙-1I的结合域的DNA分子。用于编码TALE蛋白乙-1的结合域的DNA分子为TALE基因片段乙-1(如序列表的序列8所示),用于编码TALE蛋白乙-1I的结合域的DNA分子为TALE基因片段乙-1I(如序列表的序列9所示)。
[0038]四、制备重组质粒
[0039]将TALE基因片段甲-1插入pCS2_FokI载体(PEAS型)的NheI酶切位点,得到重组质粒TALENs-2201L。
[0040]将TALE基因片段甲-1I插入pCS2_FokI载体(PERR型)的NheI酶切位点,得到重组质粒TALENs-2201R。
[0041]将TALE基因片段乙-1插入pCS2_FokI载体(PEAS型)的NheI酶切位点,得到重组质粒TALENs-2199L。
[0042]将TALE基因片段乙-1I插入pCS2_FokI载体(PERR型)的NheI酶切位点,得到重组质粒TALENs-2199R。
[0043]五、制备mRNA
[0044]取重组质粒TALENs-2201L,采用试剂盒(QiagenRNeasyMiniKit,)进行体外转录,得到TALE-RNA甲-1(将TALE-RNA甲-1反转录并测序,如序列表的序列10所示;序列表的序列10所示的DNA分子即为TALE基因甲-1,编码序列表的序列14所示的TALE蛋白甲-1)。
[0045]取重组质粒TALENs-220IR,采用试剂盒