实验2 蛋白质含量测定(考马斯亮蓝G-250法).doc

实验2 蛋白质含量测定(考马斯亮蓝G-250法)
实验三蛋白质含量测定(考马斯亮蓝G-250法)
一、目的


二、原理
蛋白质的存在影响酸碱滴定中所用某些指示剂的颜色变化,从而改变这些染料的光吸收。在些基础上发展了蛋白质染色测定方法。涉及的指示剂有***橙、考马斯亮蓝、溴甲酚绿和溴甲酚紫。目前广泛使用的染料是考马斯亮蓝。
考马斯亮蓝G-250在酸性溶液中为棕红色,当它与蛋白质通过范德华键结合后,变为蓝色,且在蛋白质一定浓度范围内符合比尔定律,可在595nm处比色测定。2~5分钟即呈最大光吸收,至少稳定1小时。~ mg蛋白质/ml范围内均可。该法操作简便迅速,消耗样品量少,但不同蛋白质之间差异大,且标准曲线线性差。高浓度的Tris、EDTA、尿素、甘油、蔗糖、***、硫酸铵和去污剂时测定有干扰。缓冲液浓度过高时,改变测定液pH值会影响显色。考马斯亮蓝染色能力强,比色杯不洗干净会影响光吸收值,不可用石英怀测定。
三、器材与试剂

(1)分析天平;(2)具塞刻度试管10ml×8;(3)吸管 ×
I,lml×Z,5ml×I;(4)研钵;(5)漏斗;
(6)离心管10ml;(7)容量瓶10ml;(8)离心机;(9)721型分光光度计

(1)标准蛋白质溶液称取10mg牛血清白蛋白,溶于蒸馏水并定容至100ml,制成 100 pg/ml的原液。
(2)考马斯亮蓝G-250蛋白试剂称取100mg考马斯亮蓝G-250,溶于50ml 90%乙醇中,加入 85%(m/v)的磷酸 100ml,最后用蒸馏水定容到 1000ml。
此溶液在常温下可放置一个月。

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四、操作步骤
1.
盖上塞子,摇匀。放置2min后在595 nm波长下比色测定(比色应在 l h内完成)。以牛血清白蛋白含量(μg)为横坐标,以吸光度为纵坐标,绘出标准曲线。

(1)准确称取约200mg绿豆芽下胚轴,放入研钵中,加入5ml蒸馏水在冰浴中研成匀浆,离心(4000r/min,10min),将上清液倒入10ml容量瓶,再向残渣中加入2ml蒸馏水,悬浮后再离心10min,合并上清液,定至刻度。
(2)另取1支具塞试管, ml样品提取液, ml蒸馏水,5ml考马斯亮蓝G-250试剂,充
分混合,放置2min后,以标准曲线1号试管做参比,在595 nm波长下比色,记录吸光度。

根据所测样品提取液的吸光度,在标准曲线上