大绒鼠（Eothenomymiletus）微卫星多态性引物的筛选.doc

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大绒鼠(Eothenomymiletus)微卫星多态性
引物的筛选
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摘要:大绒鼠是横断山区的固有种。本研究利用大绒鼠40个个体设计出12对微卫星引物,
其有效等位基因(Na)2-5个,观测杂合度(HO)、期望杂合度(HE)及多态信息含量(PIC)
,,。筛选出的12对引物中Emj2-43和
Emj2-54属于高度多态性座位,其余10对均为中度多态性座位,这些微卫星引物的筛选可10
用于今后更进一步的种群研究。关键词:分子生态学;大绒鼠;微卫星;种群结构中图分类号:Q95Isolationandpolymorphiclociofmicrosatellitein15
Eothenomysmiletus(MicrotinaeEothenomys)
ZHUWanlong,WANGZhengkun,LIUChunyan
(SchoolofLifeScience,YunnanNormalUniversity,KunMing650500)
Abstract:TheOrientalvoleEothenomysmiletus(Microtinae:Eothenomys)isanendemic
,twelvemicrosatellitelociwere

,,,mating
.
Keywords:molecularecology;Eothenomysmiletus;microsatellitemarkers;populationstructure25
0引言
微卫星DNA,又称简单重复序列(simplesequencerepeats,SSR)、短串连重复(short
tandemrepeat,STR),以1-6的短核苷酸序列(一般称为核心序列)为基本单位,呈串联重
复状分布于生物体整个基因组中[1]。微卫星序列在群体中通常具有很高的多态性,而且一般30
为共显性,因此是一类很好的分子标记[2-6]。被广泛生物遗传作图、群体遗传研究、个体间
亲缘关系鉴定等方面,且该技术的出现有助于推测种群历史上经历过的变动或预测将来的种群动态变化,以及揭示种群的重要历史进程[7-8]。
大绒鼠(Eothenomysmiletus)分布于横断山地区[9-10],属于田鼠亚科(Arvicolinae)动
物。绒鼠自化石发现于横断山以来,至今未见关于该类物种经过大规模扩散和迁移的报道。35
对该亚科动物研究有利于对上新世——第四纪原始气候和环境的了解[11-12]。本研究利用磁珠
富集方法,从大绒鼠基因组中分离筛选出微卫星位点,为进一步阐明横断山对绒鼠生存适应
及其遗传分化和物种形成奠定基础。
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1材料和方法

本研究中的中缅树鼩样本均为成年个体,分别来自云南省昆明市禄劝县屏山镇(海拔1679m,北纬25?25',26?22',东经102?13',102?57')灌丛;剑川县石龙村(海拔2500m,北纬26?15',26?45',东经99?40',99?55')果园;丽江地区(海拔2750m,北纬26?40'",东经99?.48'")灌丛,取其肝脏组织于75%酒精保存。

组织进行脱醇后用标准蛋白酶K/酚:***仿:异戊醇方法提取基因组DNA[13]。利用4只
云南剑川捕捉绒鼠混合DNA进行后续试验。

用AFLP(A:5’-TACTCAGGACTCAT-3’;B:5’-GACGATGAGTCCTGAG-3’)
50各1ul;MseI(NEB)1u;10×;ATP2ul;;,
混合反应3小时。
酶切连接反应液稀释后,用AFLP特异引物扩增,反应条件为ddH2O5ul;dNTP2ul;
Buffer2ul;;。反应体系于95?预变性5min后进入30个循环:95?30sec;
60?45sec;72?,循环结束72?10min。产物在1,的琼脂糖凝胶上进行电泳检测,
55将成功连接后电泳显示200—1000bp条带切胶回收备用。

利用5’端用生物素探针(AG)15进行杂交,杂交体系为100μl(探针10μM;12×SSC50μl;双蒸水28ul),95?变性15min,。取10mg/,用300μl1×W/Bbuffer(10mMTris-HCl,
1mMEDTA,1MNaCl)冲冼约5min,然后用磁铁将磁珠吸至管壁一侧,分离磁珠与冲洗60
液,弃冲洗液。重复上述步骤3次。后将100μl杂交液加至清洗好的磁珠中,然后放入43?
杂交炉中,混合温育2-3h。。然后加入200―L2×SSC,0(I,SDS的溶液漂洗两次,每次5min;加入200μl1×SSC,0(1,SDS的溶液在45?漂洗两次,每次5min;加入200μl1×SSC
和0(1,SDS的溶液,并于60?漂洗两次,每次5min。最后一次加入50μlTE与磁珠混匀
后于95?30min,迅速用磁铁吸附管壁,。65
取5μl上述TE溶液,向其加入5μldNTP,10×buffer5μl,TaKaRaTaqDNA聚合酶1μl,
AFLP特异引物2μl,,于95?3min,后进入30个循环:95?变性30sec;53?复性30sec;72?延伸1min,循环结束后72?再延伸10min。后将PCR产物纯化。

取PCR纯化产物与pMD18-T载体连接,将连接产物转入DH5a感受态细胞,于含有70
氨苄青霉素的LB平板培养基上,37?培养过夜。将生长出的菌落至LB液体培养基中,37
?250r/min振荡培养4~6h。取振荡培养好的菌液进行PCR检测,(10μl体系,引物为探
针的寡核苷酸链(AG)15及M13,其它反应条件如前所述),,的琼脂
糖凝胶电泳检测。
经鉴定为阳性克隆的菌液送至上海生工有限公司进行测序。利用SSRHunter软件进行75
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SSR重复序列的寻
找,确定重复次数以
及两端侧翼序列。
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根据测序结果,挑选含有微卫星片段的序列(两碱基重复单元重复次大于8次)。用
[14]。引物进行PCR检测。反应体系为25(模板DNA50ng,引物各1μl,
×TaqMasterMix,)。反应程序为:95?预变性3min;94?30s,各引物
适宜退火温度30s(表1),72?30s,共30次循环;72?延伸10min。将扩增成功的上
游引物进行荧光(FAM)标记后再次于30个样本进行PCR扩增检测其引物。产物送至上海[15]进行分析其观测杂合度(HO)、生工有限公司进行微卫星测序。(HE)及多态信息(PIC)。根据Weber(1990)提出遗传偏离指数[d=(HO-HE)/HE]
对其序列进行检测[16]。85
2结果

选用限制性内切酶MseI对大绒鼠基因组DNA进行酶切,接头连接后PCR反应得到的
片段长度主要集中在200,1000bp范围内(图1)。


AFLP特异引物扩增产物约200—1000bp(图2)。连接转化后,经PCR检测96个克95
隆中获得58个阳性克隆(图3)。
、筛选和结果分析阳性克隆进行测序后选择2碱基重复均大于8次以上的片段进行引物设计,共设计引物
14对。经过PCR检测后,其中12对引物可用于分析(表一)。12对引物共检测到微卫星
位点45个等位基因。(2,5);观测杂合度(HO)、期望100
杂合度(HE)及多态信息含量(PIC),,。
设计的12对引物中Emj2-43和Emj2-54属于高度多态性座位,其余10对均为中度多态性座位。
图2PCR检测并富集捕获目的片段的琼脂糖凝胶电泳图105
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图3克隆PCR检测的琼脂糖凝胶电泳图

表1大绒鼠微卫星引物及其特征
Table1Characteristicsofmicrosatellitemarkersfortheorientalvole(Eothenomymiletus)
退火温有效多态样本观测杂期望杂遗传偏座位重复片段登录号度等位信息引物(5’-3’)长度(bp)Size数合度合度离指数LocusrepeatGenBankPrimer(5’-3’)range(bp)a(?)(?)aNPICEmj1-22F:--:TAATGCTTCGTTGTGATGTC(AC)14*F:GCTCAACTAGAGACTTCAGTEmj1---:ATTGCACAGGTATCCAGAC(AC)16F:AGGGCTAATGGGAAATGCEmj1---:GCTGACAAGGAGTAGTAGAG(AC)21F:AACGGTTCTGGAGCATAGEmj1-49(GT)--:AGGGTTCTCTTCTTGACATT21F:AGTTCCTAATGTGTTGTCCAEmj2-20(TC)--:GAGTTGCCCTGACTTAGCEmj2-26(TG)F:--:GCTTTCCCTAATGTCTTACTTC18EmjF:GGATTGTAGGTACTCATGTAAG2-39(TTTC)--:GCAGAGGCAAGTGAATCT(CTTC)10(TC)22Emj2-43(GA)F:--:CAGACAAGAAGCAGGAAGA20F:---47(TC)5R:TGGACCTCAAGCCTGTAAEmj2-50(AG)F:--:CACTCTGCTAAGGTACTCTT21F:---54(GT)6R:CACCGAGTTGTAGAGGATTEmj2-113F:--:CCAAGCCTCTGAGTAAGTT(GA)21
1153讨论
微卫星重复序列突变率较高、等位基因的多样性显著增加,可以用于其进行生态时间尺度的计算或估计[17],且符合孟德尔遗传模式,在选择上是中性的等多种特点,非常适合作