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复制缺陷型BmNPV载体的构建及应用的制作方法
本发明公开了利用同源重组的方法构建穿梭载体BmBacmid,进而通过Red重组技术构建了一种复制缺陷型的BmNPV载体。复制缺陷型BmNPV载体RD-BmBacmid的构建方法具体为:首先构建家蚕杆状病毒穿梭载体BmBacmid,再利用Red重组技术敲除病毒复制必需基因orf1629的部分序列,从而构建复制缺陷型BmNPV载体RD-BmBacmid;该复制缺陷型BmNPV载体RD-BmBacmid可以快速构建重组病毒表达目的蛋白。上述复制缺陷型BmNPV载体RD-BmBacmid的用途是用于构建重组病毒表达目的蛋白。
【专利说明】复制缺陷型BmNPV载体的构建及应用
【技术领域】
[0001]本发明属于生物技术中利用基因工程方法载体构建的【技术领域】。
【背景技术】
[0002]昆虫杆状病毒表达系统主要有两个,一个是应用最为广泛以Sf9、Sf21细胞或苜蓿银纹夜蛾为宿主的AcMNPV载体表达系统,另一个是感染家蚕细胞或幼虫、蛹表达外源基因的家蚕杆状病毒(BmNPV)表达载体系统。在这种表达系统中重组病毒的成功构建是关键。早期的BmNPV载体系统产生重组病毒效率低,需要繁琐耗时的多步筛选步骤。目前主要是以
BmBacmid或者线性化的BmNPV为主构建重组病毒,表达目的蛋白。最近还出现了一种利用条件性复制载体转座构建重组BmBacmid的技术,利用这种技术可大大提高筛选重组BmBacmid的成功率。不过,这种操作仍然需要在特定的大肠杆菌中完成,无法脱离这个中间步骤。总之,虽然现在的技术和方法相比较早期的技术有很大进步,但最终成功构建重组病毒还是需要多步操作,相对还是比较繁琐耗时的。
【发明内容】
[0003]本发明要解决的技术问题是提供一种复制缺陷型BmNPV载体的构建及应用;本发明利用同源重组的方法构建穿梭载体BmBacmid,进而通过Red重组技术构建一种复制缺陷型的BmNPV载体。利用这种复制缺陷型载体可一步构建重组病毒,无需筛选,从而建立一种快速构建BmNPV重组病毒表达目的蛋白的方法。
[0004]为了解决上述技术问题,本发明提供一种转移载体pMD18-lef2-BAC-1629的构建方法,包括以下步骤:
[0005]l)、pMD18-lef2_1629载体构建:
[0006]①、分别进行BmNPVlef2基因片段和0rfl629基因片段的合成,
[0007]②、利用BmNPVlef2基因片段和orf1629基因片段重叠PCR合成lef2_1629片段;
[0008]③、构建pMDl8-lef2_l629:
[0009]先对Ief2-1629片段3’端加“A”,所得的加“A”后的PCR产物连接到T载体(pMD18-Tsimple),得pMD18-lef2-1629;
[0010]2)、转移载体pMD18-lef2-BAC-1629的构建:
[0011]①、细菌人工染色体BAC片段的合成
[0012]以bM0N14272DNA作为模板,利用KODFXDNA聚合酶PCR扩增BAC片段,得BAC片段PCR产物;
[0013]②、BAC片段克隆到pMD18_lef2-1629:
[0014]先将pMD18_lef2-1629与BAC片段PCR产物分别用FseI进行单酶切反应;pMD18-lef2-1629酶切产物割胶回收后去磷酸化,再与酶切回收的BAC片段PCR产物用DNALigationKitLONG试剂盒进行连接,连接产物转化HST08感受态细胞,得转移载体pMD18-lef2-BAC-1629。
[0015]本发明还同时提供了复制缺陷型BmNPV载体RD-BmBacmid的构建方法,首先构建家蚕杆状病毒穿梭载体BmBacmid,再利用Red重组技术敲除病毒复制必需基因orfl629的部分序列,从而构建复制缺陷型BmNPV载体RD-BmBacmid;该复制缺陷型BmNPV载体RD-BmBacmid可以构建(快速构建)重组病毒表达目的蛋白。
[0016]作为本发明的复制缺陷型BmNPV载体RD-BmBacmid的构建方法的改进:
[0017]家蚕杆状病毒穿梭载体BmBacmid的构建为:
[0018]取转移载体pMD18-lef2-BAC-1629DNA和四方形多角体BmNPV病毒DNA混匀后与X-tremeGENEHP转染试剂混合共转染单层家蚕BmN细胞;所得的病毒基因组DNA电转化ElectroMAXDHlOB感受态细胞,涂布于Kan/IPTG/X-galLB固体培养基上培养24~48h;然后转印至Amp/IPTG/X-galLB固体培养基上培养12h,随机挑取Kan抗性Amp敏感的蓝色单菌落接种KanLB液体培养基(50ug/mLKan),37°C摇床中220r/min振荡培养48h;得穿梭载体BmBacmid,含该穿梭载体BmBacmid的DHlOB细胞标记为BmDHlOB。
[0019]作为本发明的复制缺陷型BmNPV载体RD-BmBacmid的构建方法的进一步改进:利用Red重组技术敲除病毒复制必需基因0rfl629的部分序列,从而构建复制缺陷型BmNPV载体RD-BmBacmid包括以下步骤:
[0020]l)、orfl629基因打靶片段的制备
[0021]根据四方形多角体BmNPV病毒orfl629基因及pKD3质粒中***霉素抗性基因表达盒序列设计引物;然后以PKD3质粒DNA作为模板,KODFXDNA聚合酶进行扩增;PCR产物纯化后,得orf1629基因打靶片段;
[0022]2)、Red重组构建复制缺陷型BmNPV载体RD-BmBacmid:
[0023]以pKD46-RecA质粒转化BmDHlOB感受态细胞,在Amp/KanLB平板上筛选阳性克隆,得BmDH10B(pKD46-RecA)
感受态细胞;
[0024]所述BmDHlOB(pKD46-RecA)感受态细胞以orf1629基因打靶片段电转化后,进行筛选培养;得复制缺陷型BmNPV载体RD-BmBacmid。
[0025]本发明还同时提供了利用上述方法构建而得复制缺陷型BmNPV载体RD-BmBacmid的用途,其特征是:用于构建重组病毒表达目的蛋白。
[0026]在本发明中,所用到的引物具体如下:
[0027]Ief2基因片段上游引物Ief2-F:5’-GITTCAITTAATGCAACTTTATC-3’,下游引物Ief2-R:5’-TGTATAGTGTTGGCCGGCCTAATAAAAAACAAATTTGACA-3’(下划线标示为FseI酶切位点)。
[0028]orfl629基因片段的上游引物1629-F:5’-CAAATTTGTTTTTTATTAGGCCGGCCAACACTATACAITGTTATTAG-3’(下划线为FseI酶切位点),下游引物1629-R:5’-ATGAATTCACCACCATCATCGATGTCTG-3’(下划线标示为EcoRI酶切位点)。
[0029]弓丨物BAC-F:5,-TTGCTGATATCGGCCGGCCTTTTGCTTTGCCACGGAACGGTCTG-3’和BAC-R:5’-CAGGATCGGCCTAGGCCGGCCTTGCCGGGTCCCAGGAAAGGAT-3’(下划线标示FseI酶切位点)。
[0030]Pmndin:5’-TATGTCCAAGCTTTATTTAACGTG-3’。
[0031]K0-1629F:
[0032](5'-TAGATTCTGTGCGTTGTTGATTTACAGACAATTGTTGTACGTATTcctaaggatgggaattagccatggtcc-3'),
[0033]和K0-1629R:
[0034](5'-AAAGACGCTGAAAATCATTTGATTTTCGCTCTAACATACCACCCTAAggtgtaggctggagctgcttc-31)。
[0035]综上所述,
[0036]本发明提供了转移载体pMD18-lef2_1629和pMD18-lef2-BAC_1629的构建方法。
[0037]本发明提供了复制缺陷型BmNPV载体RD-BmBacmid的构建方法。
[0038]本发明提供了复制缺陷型BmNPV载体的应用。
[0039]本发明具有如下优点:
[0040]1、相对于线性化载体来说,BmNPV载体RD-BmBacmid通过同源重组拯救产生病毒,是一种正筛选的方法,无需进行重组病毒的筛选和纯化,因而操作更简单,省时省力。
[0041]2、相对于其他Bacmid载体来说,BmNPV载体RD-BmBacmid通过同源重组拯救产生病毒,无需通过Bac-to-Bac系统构建重组Bacmid,因而操作更直接,省时省力。
【专利附图】
【附图说明】
[0042]下面结合附图对本发明的【具体实施方式】作进一步详细说明。
[0043]图1为BmNPVlef2基因片段和orf1629基因片段的PCR扩增结果图;
[0044]M:250bpDNALadder;1:lef2基因片段PCR产物;2:orf1629基因片段PCR产物。
[0045]图2是重叠PCR合成的lef2_1629片段扩增结果图;
[0046]Ml:DL2000;1:lef2和orf1629片段重叠PCR扩增产物(10iiL);2:引物lef2_F和1629-R扩增lef2-1629片段的PCR产物(IiiL);3:凝胶纯化回收的lef2_1629片段;M2:入-EcoT141
[0047]图是3pMD18-lef2_1629的酶切鉴定图;
[0048]Ml:250bpDNALadder;1:EcoRI和FseI双酶切pMD18_lef2_1629的产物;2=FseI单酶切pMD18-lef2-1629的产物;M2:A-DNA/HindIII。
[0049]图4是细菌人工染色体BAC片段的扩增结果图;
[0050]M:A-DNA/HindIII;1:细菌人工染色体BAC的PCR产物。
[0051]图5是转移载体pMD18-lef2-BAC-1629酶切鉴定分析;
[0052]M:A-DNA/HindIII;1:FseI酶切pMD18_lef2_1629
的产物;2:BAC片段;3、4和5:FseI,EcoRI和BamHI分别单酶切pMD18_lef2-BAC_1629的产物。
[0053]图6是转移载体pMD18-lef2-BAC-1629中Ief2-BAC-orf1629的结构图。
[0054]图7是穿梭载体BmBacmid的PCR扩增BAC片段的鉴定图;
[0055]M:入-DNA/HindlII;1:引物BAC-R和Paindm扩增BmBacmidDNA的PCR产物。
[0056]图8是orfl629基因打靶片段的制备图;
[0057]M:DL2000;1:K0_1629F和K0-1629R扩增Cmr的PCR产物。
[0058]图9是复制缺陷型BmNPV载体(RD-BmBacmid)的PCR鉴定图;
[0059]M:DL2000;1:K0_1629F和K0-1629R扩增产物:2:K0-1629F和Pmntllll扩增产物。
[0060]图10是RD-BmBacmid单独转染的BmN细胞(a)以及其培养上清连续转接3轮的BmN细胞(b、c、d)。[0061]图11是RD-BmBacmid-AcGFP转染(A)及培养上清转接(B)的BmN细胞发荧光情况。
[0062]图12是RD-BmBacmid同源重组救活的验证图;
[0063]a=RD-BmBacmid和pBacPAK8_AcGFP共转染120h后的BmN细胞,b:共转染后细胞培养上清转接72h后的BmN细胞。
[0064]图13是重组GFP蛋白的WesternBlotting检测图;
[0065]M:预染蛋白分子量标准;1=RD-BmBacmid单独转染后转接的BmN细胞样品;2:共转染后细胞培养上清转接的BmN细胞样品。
【具体实施方式】
[0066]实施例1、构建含细菌人工染色体的转移载体pMD18-lef2-BAC_1629
[0067]-lef2-1629载体构建
[0068]
[0069],根据四方形多角体病毒BmNPV基因组序列(GenBank数据库中登录号:;或者参照,-788)设计合成lef2基因片段和orfl629基因片段的引物。
[0070]Ief2基因片段上游引物Ief2-F:5’-GITTCAITTAATGCAACTTTATC-3’,下游引物Ief2-R:5’-TGTATAGTGTTGGCCGGCCTAATAAAAAACAAATTTGACA-3’(下划线标示为FseI酶切位点)。
[0071]orfl629基因片段的上游引物1629-F:5’-CAAATTTGTTTTTTATTAGGCCGGCCAACACTATACAITGTTATTAG-3’(下划线为FseI酶切位点),下游引物1629-R:5’-ATGAATTCACCACCATCATCGATGTCTG-3’(
下划线标示为EcoRI酶切位点)。
[0072]以四方形多角体病毒BmNPVDNA为模板,用KOD-Plus-DNA聚合酶(购自东洋纺(上海)生物科技有限公司)和所设计的引物Ief2-F和Ief2-R、1629-F和1629-R分别进行PCR特异性扩增合成lef2基因片段和orfl629基因片段。PCR反应体系如下:
[0073]
【权利要求】
-lef2-BAC-1629的构建方法,其特征是包括以下步骤:1)、pMD18-lef2-1629载体构建:①、分别进行BmNPVlef2基因片段和orfl629基因片段的合成,②、利用BmNPVlef2基因片段和orf1629基因片段重叠PCR合成lef2_1629片段;③、构建pMD18-lef2-1629:先对lef2-1629片段3’端加“A”,所得的加“A”后的PCR产物连接到T载体,得pMD18-lef2-1629;2)、转移载体pMD18-lef2-BAC-1629的构建:①、细菌人工染色体BAC片段的合成以bM0N14272DNA作为模板,利用KODFXDNA聚合酶PCR扩增BAC片段,得BAC片段PCR产物;②、BAC片段克隆到pMD18-lef2-1629:先将pMD18-lef2-1629与BAC片段PCR产物分别用FseI进行单酶切反应;pMD18-lef2-1629酶切产物割胶回收后去磷酸化,再与酶切回收的