基因突变检出法的制作方法.docx

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专利名称:基因突变检出法的制作方法
技术领域:
本发明涉及碱基序列的检出方法,具体涉及通过检出包括含点突变等突变部位的碱基序列的碱基序列来检出基因突变的方法。
背景技术:
基因组中大量存在的基因多态性,一般认为与对疾病的易感性、药物代谢的个体差异等有深刻的关联性。这些基因多态性的检出对于所谓个性化(オ—ダ—メイド)医疗是必需的,被认为是基因组科学的临床应用的最重要研究课题之一。其中,作为基因多态性标记的SNP(单核苷酸多态性,由一个碱基取代而引起的基因多态性)最近忽然引入注目,国际上也投入了巨额的研究费用。另一方面,随着分子遗传学研究的进步,在数据库中开始贮存各种遗传疾病的基因突变。通过用它来筛选已明确是病因的已知基因突变,便可进行遗传病的论断和临床病型的预测。特别在特定群体内或超过人种高频度地存在基因突变的场合,其诊断价值很高。
在上述基因多态性和基因突变中,有碱基取代、缺失、插入、重复序列数的不同等,但其中占压倒多数的是一碱基取代的点突变。为将人基因组研究成果应用于临床领域,这种点突变的简便而快速的检出法是不可缺少的。
作为点突变的检出法,至今已提出了各种方法(参见CottonRHG,MutationDetection,-198,OxfordUnivesityPress,Oxford,1997)。代表性的方法可列举等位基因特异性寡核苷酸杂交法(ASO)、等位基因特异性扩增法、限制酶消化法、连接酶链反应、小序列法等。这些方法在DNA扩增后都必须进行杂交和电泳等繁杂的操作。另一方面,近年为适应人基因组分析研究而开发的TaqMan法、invader测定、DNA微阵列(NDA芯片)、用质谱仪的TOF-MASS法等,擅长于处理大量试样,但必须有昂贵的特殊专用设备,在临床检验室水平不容易实施。而作为基因突变的筛选法被广泛应用的SSCP法、化学切割法(Chemicalcleavage)和DHPLC法在未知基因突变的初步筛选中可发挥威力,但不适合已知突变的确实检出。此外,用序列测定法检出点突变的操作复杂,成本又高,对已知突变的检出太过专业了。上述所有方法是目前在基因分析试验室中实施的特殊检查,其在鉴定现场(临床)中迅速实施是极为困难的。
作为ASO法使用的探针,以前是使用15~25mer(参见SaikiRK,-~129,IRLPress,Oxford,1998)。有报道说,在杂交时使用与标记探针竞争的寡核苷酸可增强探针的特异性
(参见NozariG,RahberS,-globingenesβA,-28,1986)。
发明的揭示本发明的目的是提供简便而快速的基因突变检出法。
本发明者获知如果在特定条件下使用特定的引物和探针,则可在一个反应体系中进行核酸的扩增和杂交,而且杂交形成的杂交体容易被检出,根据这一发现,最终完成了本发明。
本发明提供以下各项技术内容。
(1)碱基序列的检测方法,具备用DNA聚合酶进行包括含突变部位的检出对象碱基序列的DNA的扩增的工序,使扩增的DNA和具有与检出对象碱基序列互补的碱基序列的杂交探针杂交的工序,以及检出经杂交形成的杂交体的工序;上述方法通过用于DNA扩增的至少一个引物以第一标记物标记使扩增的DNA被第一标记物标记,杂交探针以第二标记物标记,并包含在进行DNA扩增的反应液中,杂交探针的碱基序列的设定使其不抑制DNA扩增,通过亲和层析利用第一标记物和第二标记物检出杂交体而实施。
(2)(1)所述的方法,突变部位是点突变,进行DNA扩增的反应液还含有足够量的具有在点突变的位置与标记的杂交探针的碱基序列有一个碱基不同的碱基序列、且未被标记的寡核苷酸,以提高扩增的
DNA与标记的杂交探针的杂交特异性。
(3)(1)或(2)所述的方法,DNA扩增是通过PCR的扩增。
(4)试剂盒,包含用DNA聚合酶进行包括含突变部位的检出对象碱基序列的DNA的扩增所用的引物,具有与检出对象碱基序列互补的碱基序列的杂交探针,以及亲和层析所用的试验片;上述试剂盒是用于DNA扩增的至少一个引物以第一标记物标记使扩增的DNA被第一标记物标记,杂交探针以第二标记物标记,杂交探针的碱基序列的设定使其不抑制DNA的扩增,试验片可利用第一标记物和第二标记物检出扩增的DNA和杂交探针的杂交体的试剂盒。
(5)(4)所述的试剂盒,突变部位是点突变,并且还包含具有在点突变的位置与标记的杂交探针的碱基序列有一个碱基不同的碱基序列、且未被标记的寡核苷酸。
(6)(4)或(5)所述的试剂盒,引物是PCR用引物。
附图的简单说明
图1是本发明检出法的原理(以正常DNA作试样时)的示意图。
图2是本发明检出法的原理(以突变DNA作试样时)的示意图。
图3是本发明的检出法的一例的操作示意图。
图4表示使用17mer的杂交探针时的检出结果(色谱照片)。
图5表示使用17mer的杂交探针、添加竞争探针时的检出结果(色谱照片)。
图6表示使用不同长度的杂交探针、添加竞争探针时的检出结果(色谱照片)。
图7表示使用12mer的杂交探针、添加竞争探针时的检出结果(色谱照片)。
图8表示涉及各种突变的检出结果(色谱照片)。
图9表示涉及各种突变的检出结果(色谱照片)。
实施发明的最佳方式<1>本发明的检出法本发明的检出法是具备用DNA聚合酶进行包括含突变部位的检出对象碱基序列的DNA的扩增的工序、使扩增的DNA和具有与检出对象碱基序列互补的碱基序列的杂交探针杂交的工序、以及检出经杂交形成的杂交体的工序的碱基序列的检测方法;该方法的特征是,通过用于DNA扩增的至少一个引物以第一标记物标记使扩增的DNA被第一标记物标记,杂交探针以第二标记物标记,并包含在进行DNA扩增的反应液中,杂交探针的碱基序列的设定使其不抑制DNA的扩增,通过亲和层析利用第一标记物和第二标记物检出杂交体而实施。以下对每一工序进行说明。
(1)DNA的扩增DNA的扩增只要使用DNA聚合酶进行即可,没有特别限制,可采用包括用DNA聚合酶合成DNA的阶段的扩增方法。作为DNA扩增的方法的例子,可例举PCR法、TMA法、NASBA法、LAMP法等。
用DNA聚合酶合成DNA时,必需有引物。引物依赖扩增的方法和检出对象碱基序列,用公知的方法设定。本发明
中,用于DNA扩增的至少一个引物以第一标记物标记使扩增的DNA被第一标记物标记。
例如,用PCR法进行扩增时,使用一对引物,通过标记其中至少一个,使扩增的DNA被标记。用NASBA法和TMA法进行时,通过标记在DNA合成阶段起作用的引物,用LAMP法时,通过标记至少一个内引物(innerprimer),使扩增的DNA被标记。
进行引物的标记,应不抑制DNA的合成反应。这样的标记可按公知的方法进行,通常标记引物的5’末端。
用于标记的标记物,只要存在与其以生物特异性方式结合的物质即可。作为该标记物与对其能生物特异性结合的物质的组合,可列举抗原与抗体、酶与抑制剂、糖链与外源凝集素、激素与受体、金属结合蛋白与金属元素。具体可列举***配体与抗***配体抗体、生物素与链霉抗生物素蛋白等的组合。这样的组合中,任一个作标记物都可以,但通常用分子量小的一个作标记物。
所用的引物和DNA的扩增条件可根据所采用的扩增方法和检出对象序列适当确定。例如,PCR法可参照MolecularCloningALaboratoryManual(3rded.),Volume2,Chapter8,-,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,2001,NASBA法可参照
PCRMethodsandApplications,1,25-33(1991),LAMP法可参照NucleicAcidsResearch,,,-vii(2000)。
扩增时,作为模板的试样DNA可用通常的方法由检查试样调制。
检出对象序列可配合扩增方法适当选择,使包括突变部位的检出对象序列能特异地扩增。检出对象序列包括的突变部位通常是已知发生基因突变和基因多态性的部位。突变部位既可以是点突变,也可以是插入、缺失等突变。
作为本发明检出法的检出对象的基因突变和基因多态性的一般的例子,可列举糖原贮积病Ia型的日本人患者中高频度出现的g727t突变、中链酰基CoA脱氢酶缺乏症的白人患者中高频度出现的a985g突变(Lys329Glu突变)、高甘氨酸血症的芬兰人患者中高频度出现的GLDC基因的g1691t突变(Ser564Ile突变)、药物代谢酶基因CYP2C19中的基因多态性(CYP2C19*2,g681a)、决定乙醇代谢的个体差异的醛脱氢酶2的基因多态性(E487K)、囊性纤维化跨膜传导型调节蛋白基因的deltaF508缺失突变、泰-萨氏病(Tay-Sachsdisease)的HEXA基因的1277insTATC插入突变、乳腺癌的BRCA1基因的5382insC插入突变、乳腺癌的BRCA2基因的6174delT缺失突变、血栓形成凝血第五因子基因的G1691A点突变等,本发明的检出法的检出对象并不限于这些例子。
糖原贮积病Ia型,由于糖原代谢途径中的葡萄糖-6-磷酸酶异常而发生,是主要在肝脏内贮积大量糖原的先天性糖代谢异常,采取常染色体隐性遗传的形式。可见低血糖、肝肿大、低身长、肾功能不全、高脂质血症、高尿酸血症等。该酶基因中的g727t突变是占日本人病例约90%病因突变的高频度突变,引起mRNA的剪接异常。直到最近,该病的诊断还用肝组织进行酶活性测定,由于基因论断的出现,就不需要肝活检了。该突变在日本人群体中的基因保持者数目约为200人中1人。
非***体症型高甘氨酸血症因甘氨酸分解酶的异常而发生,是新生儿期出现痉挛等严重神经症状的先天性氨基酸代谢异常(常染色体隐性遗传)。芬兰人患者高频度(突变基因的约70%)出现甘氨酸分解酶中GLDC基因g1691突变。该突变引起氨基酸取代Ser564Ile。
中链酰基CoA脱氢酶缺乏症起因于脂肪酸β氧化途径中起重要作用的酶(medium-chainacyl-CoAdehydrogenase,MCAD)的异常,是引起空腹、感染时低血糖、意识障碍的先天性有机酸代谢异常症(常染色体隐性遗传)。已知其常被误诊为婴幼儿猝死综合征和急性脑病(麻风综合征)。该酶基因中的a985g突变是占白人病例约90%病因突变的高频度突变,引起氨基酸取代Lys329Glu。该基因突变的基因保持者在白人群体中占高比率(英国为40人中1人)。在欧美,检查该
a985g突变的基因诊断被广泛应用于该病的诊断。
CYP2C19基因对于奥美拉唑(胃酸分泌抑制剂)等的代谢起着重要作用。该基因上的SNP多态性的CYP2C19*2,通过外显子5的681G>A突变引起剪接异常,因而使这些药物的代谢活性下降。具有这样的多态性的人(弱代谢者),给药时必须减量,如能在给药前预先确定基因型,将对临床治疗有利。日本人群体中,发现基因的约23%是该基因多态性。
醛脱氢酶2的基因多态性(Glu487Lys)是日本人中较多出现的SNP,决定乙醇代谢的个体差异。具有基因多态性的酶活性低,由醇生成的乙醛的代谢慢,因此是“酒量低”的体质。日本人群体中约30%是该基因多态性的杂合子,约5%是纯合子。
(2)杂交扩增的DNA和具有与检出对象碱基序列互补的碱基序列的杂交探针的杂交,除了使用特定的杂交探针,可与通常的杂交同样进行。
本发明使用的杂交探针以第二标记物标记,并包含在进行DNA扩增的反应液中,杂交探针的碱基序列的设定使其不抑制DNA的扩增。
第二标记物除了使用与第一标记物不同的物质之外,与对第一标记物说明的情况相同。杂交探针的标记可用公知的方法进行,使其不抑制杂交。杂交探针的标记较好是在3’末端进行,由此可防止DNA扩增反应中的寡核苷酸链长的伸长。链长伸长时,
Tm值上升,即使有错配序列,也可能发生杂交。
将杂交探针的碱基序列设定成不抑制DNA的扩增,通常通过设计杂交探针的链长等使杂交探针的杂交在DNA扩增的条件下不会发生。
由于本发明使用的杂交探针的碱基序列被设定成不抑制DNA的扩增,可从最初即包含在进行DNA扩增的反应液中。因此,通过设定使扩增的DNA和杂交探针杂交的条件,可使DNA扩增结束后的反应液直接杂交。
杂交探针的链长和使其杂交时的条件可根据DNA扩增所用的方法适当确定。使用DNA聚合酶的DNA扩增,可在适于发挥DNA聚合酶活性的温度条件下进行扩增,可设定链长使该温度下不发生杂交。发生杂交的温度只要不抑制DNA扩增即可,没有特别的限制,较好是生成的杂交体在室温下不解离的温度。
作为确定碱基序列使之不抑制DNA扩增的条件,具体可列举设定成探针的Tm值与引物的Tm值相比要低25~40℃(较好为30~35℃)。
例如,如果考虑PCR法的通常的条件,探针通常是10mer~13mer。作为等位基因特异性寡核苷酸杂交法的探针,与以前用的15mer~25mer(参考非专利文献2)比较,是相当短的。在目前大多使用更长的链长的探针的背景中,存在着一种逻辑,即在整个基因组序列(30亿个碱基对)中,为通过4种碱基组合而制成具特异性的探针,至少必需有