抗cd4和趋化因子受体结构域复合物的抗体及其抵抗hiv感染的应用的制作方法.docx

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专利名称::抗cd4和趋化因子受体结构域复合物的抗体及其抵抗hiv感染的应用的制作方法发明概述本发明涉及按照所述的方法及筛选步骤以能表达CD4的T淋巴细胞,例如外周血单核T细胞,胸腺细胞,脾细胞和白血病或淋巴瘤衍生的T细胞系例如HPB-ALL或SUP-T细胞作为免疫原生产的单克隆抗体。本发明单克隆抗体的特性在于其能在体内或体外中和人类免疫缺陷病毒(HIV)及相关的免疫缺陷病毒的原代分离物。此抗体是针对含有与趋化因子受体的结构域结合的CD4蛋白质的宿主细胞抗原复合物的,对第一型的HIV(HIV-1)所有分化体的原代分离物和第二型的HIV(HIV-2)及猿猴免疫缺陷病毒(SIV)的原代分离物具有广泛的中和活性。本发明也涉及筛选及制造此种抗体的方法,能分泌此类抗体的杂交瘤,含有此抗体的药物组合物和在灵长类,包括人类中,用此类抗体在接触病毒前后预防免疫缺陷病毒所造成的感染,此类抗体的原靶为可表达CD4的淋巴细胞。
背景技术:
:距发现HIV为获得性免疫缺陷综合征(艾滋病)病毒以来已有12年,而对艾滋病毒的分子克隆和表征也已有10年,尽管有许多的研究致力于疫苗的开发,但对HIV疫苗及其免疫疗法的发展仍存在许多的困难。这些障碍包括HIV-1的变异性,病毒的多种传染途径
/方式,以及有关预防HIV感染所必需的免疫反应知识的不足。在1995年7月28日发表的一篇文章(细胞82:175-176)中,DavidBaltimore要所有这个领域中的科学家退一步想为什么在动用了美国国家卫生院(NIH)10%的预算后,对于此种病毒感染仍一无所知。早期对有效的重组HIV-1外壳亚单位疫苗(如gp120和gp160疫苗产品)抱持乐观的态度,因在数次临床试验中的疫苗血清能在体外中和实验室所分离出的HIV-1(Belshe等人,JAMA,1994,272:475;Keefer等人,AIDSResHumRetroviruses,1994,10:1713)。但此种乐观态度不久即因疫苗血清无法中和由病人体内分离出的HIV-1原代分离物而有所动摇(Hanson,AIDSResHumRetroviruses,1994,10:645;Mascola等人,传染病杂志,1996,173:340)。这些令人失望的结果使得NIH在1994年6月决定延缓进行数种基于重组外壳蛋白质的HIV亚单位疫苗的昂贵的大型功效试验。HIV-1的原代分离物获自病人外周血单核细胞(PBMCs)或具有未感染的PBMCs的血浆所作的有限培育。它们非常类似能感染人类的HIV株(Sawyer等人,病毒学杂志,1994,68:1342;Cornelissen等人,病毒学杂志,1995,69:1810)。HIV-1的原代分离物可很容易与常用的已适应实验室环境的亲T型细胞的病毒如Ⅲb/LAI,SF2,和MN,区分开来,这些病毒已在人类
T淋巴样细胞系中生存了好几代的时间且已完全能适应在这些T细胞系中生长。首先,大部分原代分离物为亲M细胞的病毒。它们不易在培养的T细胞系中生长,相反,虽然它们也可以感染初级T细胞,但一般而言这类病毒是亲单核细胞或巨噬细胞的(Cheng-Mayer等人,科学,1988,240:80)。其次,原代分离物对由重组可溶性形式的病毒受体蛋白质CD4(rsCD4)所作的体内中和具有相当高的抗性,需要比实验室株多200-2700倍的rsCD4(Daar等人,PNASUSA,1990,87:6574-6578)。第三点,原代分离物对以gp120疫苗所引发的中和性抗体也具有抗性(Mascola等人)。原代分离物包括可在PBMC培养中诱发合胞体形成的合胞体诱发分离物(SI)和非合胞体诱发(NSI)分离物两种。在SI原代分离物中,大部分能在对HIV-敏感的T细胞系MT2中进行复制,但少数可在宽容性较小且已转化的T细胞系如CEM或H9中进行复制,这些细胞一般用来培养适于实验室生存的分离物。非合胞体诱发(NSI)原代分离物只能在外周血的初级T细胞中进行培养。早期对艾滋病疫苗的乐观态度一方面也来自猿猴免疫缺陷病毒(SIV)的灭活病毒制品。SIV与HIV-1在外观,基因排列,感染及疾病发展过程均极为类似,因此使得SIV在恒河猴中的感染成为探索不同艾滋病疫苗策略的一种极佳的模型。以此模型所作的早期研究显示在人类T细胞系中生长且在佐剂中配制的SIV的灭活制品可保护实验接种了以人类细胞培育出的高感染性
SIV病原性变体的恒河猴不受病毒的感染(Desrosiers等人,PNASUSA,1989,86:6353-6357;Murphey-Corb等人,科学,1989,246:1293)。意料之外的是,当用在同源性猴子细胞上生长的SIV原种来攻击免疫的动物时这种保护作用就丧失了。稍后由以猴子细胞培育的SIV和未感染的人类细胞进行的免疫研究中发现在那些早期SIV研究中对病毒感染的保护作用可能是因其刺激了对异种人类宿主细胞蛋白质而非病毒编码抗原的免疫应答所致(Stott,自然,1991,353:393)。牵涉到SIV的被动免疫实验中的一些证据显示某些抗细胞抗体在缺乏细胞介导的免疫下可能对SIV所造成的感染有保护作用(Gardner等人,AIDSResHumRetroviruses,1995,11:843-854)。由抗细胞抗体所提供的对SIV感染的保护性免疫机制目前仍不清楚。由抗细胞抗体所介导的对SIV感染的保护作用的可能机制之一牵涉到与病毒结合的细胞蛋白质。已知免疫缺陷病毒如HIV和SIV均会与细胞蛋白质结合,此蛋白质可能得自当病毒由宿主细胞膜上芽生时的宿主细胞。某些与主要组织相容性复合体(MHC)结合的细胞蛋白质,β2-微球蛋白,HLA-DR,和第Ⅰ类HLA分子的抗体,参与体外中和SIV和HIV-1的实验室株(Arthur等人,科学,1991,258:1935)。除了与MHC结合的表面蛋白质外,Montefiori等人(病毒学,1994,205:82;AIDSResHumRetroviruses,1995,11:1429)最近在以人类细胞培育的
SIV及HIV-1病毒表面上鉴别出三种补体控制蛋白质,CD46,CD55,和CD59,因此出现了这些宿主细胞分子也可被病毒利用作为躲避补体病毒溶解机制的可能性。另一抗细胞抗体的保护机制可能是通过以一种以前所不知道的方式抑制免疫缺陷病毒对免疫系统细胞的活性介导的。似乎有一种与宿主T细胞表面CD4结合的宿主细胞抗原复合物能促进病毒的结合和进入,进而成为保护性抗细胞抗体的靶。在本发明仍在进行的阶段中,近来也有报导指出除了宿主抗原复合物上的CD4受体能与HIV结合外,其它因子或HIV共同受体也能影响HIV的复制,进入或融合。这些包括由CD8+T细胞所产生的三种能抑制HIV的趋化因子(Cocchi等人,科学,1995,270:1811-1815);一种在表达CD4的细胞上的亲T型而非亲M型的HIV-1融合和进入的CXC-CKR4共同受体(亦称为融合素或LESTR)(Feng等人,科学,1996,272:873),能结合三种抑制性趋化因子(Cocchi等人)之β-趋化因子受体CC-CKR5以作为亲M型而非亲T型的HIV-1的共同受体(Doranz等人,细胞,1996,85:1149;Dragic等人,自然,1996,381:667;Choe等人,细胞,1996,85:1135;Deng等人,自然,1996,381:661;Alkhatib等人,科学,1996,272:1955),及作为亲M和双亲性HIV共同受体的其它β-趋化因子受体(CC-CKP2b和CC-CKR3)(Doranz等人,细胞,1996,85:1149)。据报导这些共同受体是与以前描述的G蛋白偶联且具有七个跨膜区段的受体
(Loetscher等人,生物化学杂志,1994,264:232;Samson等人,生物化学,1996,35:3362)。为了能更精确地鉴别这种能引发保护反应的推定的细胞蛋白质,且更好地表征由抗细胞抗体所介导的保护作用机制,本发明人针对抗多种细胞抗原β2-微球蛋白,MHC第Ⅰ类HLAA,B,C分子及MHC第Ⅱ类HLADR蛋白质,和其它与T细胞系有关的T细胞抗原的一组单克隆抗体的成员鉴定了其中和HIV的活性,以鉴别出那些能在体外微小空斑中和测定中能够中和HIV原代分离物的抗体。实验目的是测定那些具有此种活性之抗体的中和活性的范围;并确定在适当的动物模型中此种体外活性是否可以被有效地转换成体内活性。这些实验的结果显示,除了针对包含CD4的宿主细胞抗原复合物的抗体外,没有任何一种其它抗细胞抗体(排除CD4特异性抗体),能在中和测定中有效地中和HIV原代分离物。这些结果也显示针对包含与趋化因子受体结构域结合的CD4的宿主细胞抗原复合物的抗体能促进与rsCD4的结合。再者,被鉴别出具有所需性质的抗体能抑制猴子体内SIV所引起的感染及小鼠体内HIV-1对重组的人类免疫系统的感染。本发明的简要说明本发明首次提供的抗体及其同源物可以(1)抑制HIV与表达CD4的细胞之间的结合,(2)抑制HIV诱发的在表达CD4的细胞间的合胞体形成,(3)有效中和由第Ⅰ型HIV的所有分化体,及各种第Ⅱ型HIV和SIV中分离出的原代分离物对
CD4阳性细胞的体外感染,(4)在接触这些病毒之前或之后有效中和HIV-1的原代分离物对CD4阳性细胞的体外感染,(5)当这些抗体以非经肠胃途径施用,即静脉或腹膜内注射时,可以预防HIV和SIV的原代分离物对灵长类包括恒河猴及人类的感染,(6)以接触前和接触后方式预防HIV-1的原代分离物对经人类外周血淋巴细胞重组的SCID小鼠(hu-PBL-SCID)的感染。因此本发明涉及可与表达CD4之人类细胞表面上的含CD4的人类宿主细胞抗原复合物结合且具有中和HIV的原代分离物,即由患者身上所分离出且仅在外周血单核细胞(PBMC)中传代不超过3-5次的病毒能力的抗体。更明确地说,本发明是关于针对存在于含有与趋化因子受体例如CC-CKR5的结构域结合的CD4蛋白质的宿主细胞抗原复合物上的抗原决定簇的抗体,能广泛有效地中和所有HIV-1分化体的原代分离物及各种HIV-2和SIV的原代分离物。本发明也涉及经静脉内和/或腹膜内途径以5-10×106表达CD4的细胞,优选衍生自人类T白血病或淋巴瘤的细胞系例如来自患有T型急性淋巴母细胞白血病患者的HPB-ALL细胞,或来自患有T细胞非霍金氏淋巴瘤患者的SUB-T细胞免疫非人类哺乳动物制备此抗体的方法,清洗细胞后重新悬浮于PBS或佐剂如弗氏完全佐剂中;接着进行两次以上的静脉或腹膜内注射5-10×106清洗后悬浮于无佐剂的PBS中的细胞。已知由免疫动物产生的抗体其血清抗体具有可结合下列物质的能力
;;-ALL或SUP-T细胞的表面;-AA20,AA81-AA92,AA79-AA88,AA60-AA109,AA118-AA165,AA235-AA251,AA297-AA351,或AA361-AA375;。本发明的抗体可进一步表征为通过HIV或SIV的原代分离物在ED50<50mg/Kg的浓度下感染灵长类动物或hu-PBL/SCID小鼠提供被动免疫。本发明也包括能分泌具有这些特性之抗体的杂交瘤。含这些抗体的预防及治疗组合物,用于预防由那些原靶为表达CD4的淋巴细胞的感染因子所造成的灵长类动物,包括人类的免疫缺陷病毒感染。本发明的抗体及其同源物可识别含CD4分子,特别是当与存在于CD4表达细胞上的其它趋化因子受体如CC-CKR5的结构域结合时,的宿主细胞抗原复合物上"不连续的散布的构象性"表位。这些抗体结合在衍生自人类CD4四个胞外域中任一结构域的合成模拟物(表1;SEQIDNO:1)上,所说的胞外域包括以下肽CD4的AA1-AA20,AA81-AA92,AA79-AA88,AA60-AA109,AA118-AA165,AA235-AA251,AA297-AA351,和AA361-AA375。本发明也涉及抗体同源物。这些包括单克隆抗体,重组抗体,重组嵌合抗体(其抗体结构域来自某种动物且与人类抗体结构域或人源化抗体融合)。本发明的抗体同源物优选的是具有重链及轻链的完整的免疫球蛋白分子。此外,本发明的
CD4反应性抗体同源物可以以Fab片段,Fab′片段,F(ab′)2片段,F(v)片段或任何具有上述结合性质的其它免疫球蛋白片段形式存在。本发明所提供的优选的抗体或抗体同源物为称为B4或M2或B13的小鼠单克隆抗体。同时也提供了能产生本发明的抗体同源物的杂交瘤,通过培养这些细胞筛选及制造此抗体同源物的方法,及制备本发明杂交瘤的方法。表1用于抗CD4表位定位实验的CD4肽*肽通过作为CD4肽段一部分存在的两个内源性半胱氨酸残基形成环状或者是在CD4肽段的N端和C端上加上半胱氨酸残基以促进其环化。(C)在现存的CD4肽片段中加上的额外的半胱氨酸。≠HBVTh(FFLLTRILTIPQSLD,SEQIDNO:2)代表衍生自HBsAg蛋白质具有非选择性T辅助细胞功能的肽段。GG插在CD4位点和T辅助细胞表位之间作为间隔基的(甘氨酸-甘氨酸)。附图的简要说明图1代表由核酸序列中所推测出的人类CD4的氨基酸序列(SEQIDNO:1),即宿主抗原复合物的一部分。氨基酸以单字母代码表示如下丙氨酸A半胱氨酸C组氨酸H甲硫氨酸M苏氨酸T精氨酸R谷氨酰***Q异亮氨酸I苯丙氨酸F色氨酸W天冬酰***N谷氨酸E亮氨酸L脯氨酸P酪氨酸Y天冬氨酸D甘氨酸G赖氨酸K丝氨酸S缬氨酸V使用Littman等人的校正编号系统(细胞,1988,55:541),AA1-AA110,AA111-AA181,AA182-AA287,AA288-AA375,AA376-AA393
,和AA394-AA433分别代表CD4分子的第一,二,三,及第四个胞外域,跨膜结构域,及胞质区。图2示出了三个理论上可能的表位构型。抗体仅以Fv片段的略图描绘。实心长方形代表与表位的氨基酸相接触的抗体部分。表位的氨基酸以小圆圈表示。如果表位的氨基酸形成一条连续的肽序列,则此表位可被认定为"呈线性"(如MAbsE31及E6);如果因构象折叠使氨基酸在空间上相邻的两个或数个肽段上分散开,则此表位可被称为"不连续的"(如MAbsJ33,H5,D5,E2及I26)。最极端的例子被称为"不连续的散布的",其中许多不连续的位点,衍生自复合物中一或一个以上的分子,通过构象折叠联合形成一延伸的表位(例如MAbsB4和M2的表位)(由Meloen等人修饰,AnnBiolClin,1991,49:231)。图3是六种真正的抗CD4抗体,两种能识别含与趋化因子受体结合的CD4的宿主细胞抗原复合物,和豚鼠αrsCD4血清在表达CD4的HPB-ALL细胞上所观察到的三种不同结合类型的简单示意图帽状,不规则斑点状及团状。在免疫荧光测定中,于高分辨率荧光显微镜下B4或M2与HPB-ALL细胞的结合呈现帽状(A)的荧光点。每一种抗CD4抗体或豚鼠αrsCD4血清与HPB-ALL细胞的结合呈现不规则斑点状(B)的荧光点。标记了FITC的HIV-1的gp120蛋白质与HPB-ALL细胞的结合则呈现团状(C)的荧光点分布。图4显示在剂量依赖性研究中,趋化因子受体CC-CKR5第3