血清中葡萄糖浓度的测定.ppt

血清葡萄糖浓度的测定(GOD-POD法)
小组成员:石子涛****文
盛世豪蒋勇
实验目的
掌握酶法测定血清葡萄糖浓度的原理。
掌握血糖变化的临床生理意义。
知识窗
酶法分析是指用酶作为工具定量测定某种物质含量的分析方法。定量分析的目标可以是酶的底物,辅酶,也可以是酶的激活剂或抑制剂。
其分类如下:
单酶反应定量法:指用一种酶为工具酶定量测定某种物质的方法。
偶联酶反应定量法:当单酶反应底物或产物反应底物或产物噢物理化学手段无法区分时,还可以借助另一种酶作为指示酶,通过偶联反应进行定量分析。
由于酶法检测具有快速、渐变、准确、无不良反应、灵敏等优点,现已逐步取代其他方法,在临床诊断中应用广泛。(详见实验教程P103-104)
实验原理
酶法测定血清葡萄糖是用以过氧化物酶作指示酶的偶联酶反应定量法。
葡萄糖氧化酶(GOD)利用氧将葡萄糖氧化成葡萄糖酸,同时释放出过氧化氢。过氧化物酶(POD)催化过氧化氢氧化色素原,并使色素原氧化成红色醌类化合物(色素),即Trinder反应。其生成量与葡萄糖含量成正比。
补充:
葡萄糖氧化酶(GOD): 是从特异青霉(Penicillium notatum)等霉菌和蜂蜜中发现的酶。近白色粉末,溶于水,几不溶于乙醇、***仿和***。最适pH 55°C
过氧化物酶(POD): 是由微生物或植物所产生的一类氧化还原酶,它们能催化很多反应。过氧化物酶是以过氧化氢为电子受体催化底物氧化的酶。主要存在于细胞的过氧化物酶体中,以铁卟啉为辅基,可催化过氧化氢氧化酚类和***类化合物,具有消除过氧化氢和酚类、***类毒性的双重作用。
实验器材与试剂
(一)器材
5ml移液管,50或100ul微量可调式移液器
721E型分光光度计,37度恒温水浴锅
(二)试剂
(1)():,,溶于蒸馏水800ml中,调节pH=,定容至1L
(2)酶试剂:取过氧化物酶12 000 U,葡萄糖氧化酶1 200 U,4-氨基安替比林10mg,叠氮化钠100mg,溶入磷酸盐缓冲液80ml中,用磷酸盐缓冲液定容至100ml,置于4℃保存。
(3)酚溶液:称取重蒸馏酚100mg,溶入蒸馏水100ml中,用棕色瓶储存。
(4)酶酚混合试剂:将酶试剂及酚溶液等量混合,4可放一个月。
(5)苯甲酸钠溶液(12mmol/L):,于800ml蒸馏水中加温助溶,冷却后加蒸馏水定容至1L。
(6)葡萄糖标准储存液(100mmol/L):,溶入约70ml 12mmol/L苯甲酸钠溶液中定容至100ml。2h以后方可使用
(7)葡萄糖标准工作液(5mmol/L):,用12mmol/L苯甲酸钠溶液稀释至100ml。
操作步骤
取试管3支,按表操作
试剂/ml
空白管
标准管
测定管
血清
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葡萄糖标准液
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蒸馏水

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酶酚混合试剂



混匀,置37℃水域中,保温25min,在波长510nm比色处,以空白管调零,读取标准管及测定管的吸光度
血清中葡萄糖浓度的测定
血糖检测如果不及时送检和分离血清,全血中的血细胞会酵解血清中的G加以利用,使血糖的检测结果偏低
葡萄糖氧化酶法检测血糖时,由于血清中还原性物质(Vitc,谷胱甘肽、尿酸、胆红素等)竞争与过氧化氢(H2O2)反应,使反应生成的红色醌类化合物减少,检测结果偏低。
受饮食、取血部位及测定方法的影响
血糖检测影响因素
注意事项
葡萄糖氧化酶对β-D-葡萄糖高度特异,溶液中的葡萄糖约36%α型,64%为β型。葡萄糖的完全氧化需要α型到β型的变旋反应。新配制的葡萄糖标准液主要是α型,故须放置2h以上,待变旋平衡后方可应用。
(1)葡萄糖氧化酶法可直接用于测定脑脊液葡萄糖含量,但不能直接测定尿液葡萄糖含量。因为尿液中尿酸等干扰性物质浓度过高,可干扰氧化酶反应,造成结果假性偏低。
(2)对于血液样品需及时分离红细胞因红细胞的酵解将导致测定结果偏低,建议测定样品以草酸钾-***化钠为抗凝剂以抑制糖酵解。(取草酸钾6g,***化钠4g,加水溶解至100ml,,在80℃以下烤干使用,可使2到3ml血液在3到4天内不凝固并抑制糖分解)
(3)严重黄疸,溶血及乳糜样血清应先制备无蛋白血滤液,然后在进行测定。
(4)试剂避免与皮肤接触,缓冲液中含叠氨钠、酚试剂有毒