电泳技术.ppt

电泳技术
1 电泳:带电粒子在电场中向着与其本身电荷相反的电极移动的过程。
2 电泳技术优点:快速、准确、重现性好
3 电泳方法分类
按电场分:常压(<500V,适用大分子)、高压(>500V,适用小分子)
支持体分:自由电泳、区带电泳
仪器装置分:水平式、垂直式、悬架式
4 电泳条件:水溶液(缓冲液)、支持物(区带电泳)、电场(电泳仪、电泳槽)
一电泳的基本原理
电泳分离:
移动方向:带电性质决定
泳动度:带电颗粒在单位电场强度下的移动速度。
μ=v/E=(d/t)/(V/l)=(dl)/Vt
影响μ的因素:
1颗粒本身:带电、大小、形状
2 外界因素:电场强度E、pH、离子强度I、电渗、缓冲液粘度及温度等。
二纸电泳
以滤纸为支持体的电泳技术
操作要点:
1 选择缓冲液
对显色剂和紫外光吸收等观察区带的方法无影响
A 分离蛋白质,pI≈ 5,(、、)
B 分离氨基酸:邻苯二甲酸氢钠、磷酸—醋酸,
C 分离核苷酸巴比妥-,柠檬酸pH2~3
D 分离糖类:HAC-NaAC, pH3~5
2 滤纸的选择与处理
层析用滤纸,纸宽2~3cm/样品组分,长短影响电场强度。
3 点样
点圆点(量少)、点条状(一般),点中间(未知样品)、点一边(已知样品)
干法、湿法
4 电泳
电桥水平、加盖、电压稳定、注意时间
5 显色及分析
蛋白:溴酚兰、氨黑10B、偶氮胭脂红B
Aa:茚三酮、靛红
核酸:紫外光下观察
一般洗脱定量
三薄膜电泳
支持体:薄膜
优点:分辨力较高、简便、快速、区带清晰、易于定量、便于保存
广泛应用于蛋白质和同工酶等的分离分析
操作
1 薄膜的处理与放置
2 点样
平衡
3 电泳:E 10~25V/cm,~2h
4 显色
四薄层电泳
将支持物与缓冲液调制成适当厚度的薄层进行电泳。
常用支持物:淀粉、琼脂、纤维素粉、硅胶等
操作:
1 缓冲液选择
离子强度较高的缓冲液
2 支持物处理
精制品
3 薄层板制作
4加样:挖沟、混合样品、填埋
5 电泳
6分析:印染法
五凝胶电泳
支持物:多孔凝胶
聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶等
具有电泳和分子筛的双重作用,分辨力高
最常用聚丙烯酰胺凝胶,原因:
机械强度好,透明有弹性,稳定,无吸附作用和电渗作用,可制成不同孔径的凝胶。
分类:垂直管型盘状电泳、垂直板型电泳;
连续、不连续、梯度、SDS凝胶电泳