生化试验.doc

生化试验报告题目:啤酒酵母蔗糖酶提取、分离纯化、性质鉴定及反应动力学实验生物三班 45110306 盛布雷 — 一、目的要求: 1 、熟悉工作曲线的制作方法及注意事项; 2 、掌握 3, 5- 二硝基水杨酸( DNS )比色定糖的原理和方法; 3 、掌握 Folin- 酚法测定蛋白质含量的原理和方法; 4 、掌握酶蛋白分离提纯的原理; 5 、掌握酶的比活力测定及其计算方法; 6 、掌握酶促反应动力学中用双倒数法测定 Km 的方法; 7 、运用正交试验法确定温度、 pH 值、离子浓度的最适条件。二、实验对象: 啤酒酵母蔗糖酶蔗糖酶(Sucrase , EC. ) 又称为转化酶(Invertase) , 是催化蔗糖水解成为果糖和葡萄糖的一种酶, 广泛存在于动植物和微生物中,主要存在于酵母中。三、实验步骤及原理: 1、蔗糖酶的提取; 自溶法: 将新鲜的生物材料存放于一定的 pH 和适当的温度下, 细胞结构在自身所具有的各种水解酶( 如蛋白酶和酯酶等) 的作用下发生溶解, 使细胞内含物释放出来。 2、蔗糖酶的纯化; 凝胶层析的定义: 凝胶是一种具有多孔、网状结构的分子筛。利用这种凝胶分子筛对大小、形状不同的分子进行层析分离,称凝胶层析。凝胶层析常见名称:凝胶过滤、分子筛层析、排阻层析、凝胶渗透层析。凝胶层析是利用凝胶把分子大小不同的物质分离开的一种方法, 其原理是分子筛效应, 混合样品如同“过筛”一样, 因分子大小的不同得以彼此分开。在洗脱过程中, 大分子不能进入凝胶内部, 而沿凝胶颗粒间的空隙最先流出柱外;而小分子可以进入凝胶颗粒内部的多孔网状结构, 路径长、流速慢,以至最后流出柱外。离子交换层析基本原理: 以离子交换剂为固定相, 以特定的离子溶液为流动相, 利用离子交换剂对待分离的各种离子结合力的差异, 而将混合物中不同离子进行分离的层析技术。 3、各纯化级别蔗糖酶的活力测定; DNS 法测定蔗糖酶活力(本实验): 3,5- 二硝基水杨酸比色定糖的原理: 在一定范围内还原糖的量与反应液的颜色强度成一定比例关系(可于比色测定) ,所以可用 DNS 比色法测定还原糖的含量。 2、蔗糖酶活力测定的原理: 1 )蔗糖酶催化的反应是: 2 )蔗糖酶活力的规定:在本实验条件下,每 3 分钟释放 1 毫克还原糖所需的酶量定义为一个活力单位。 3 )该方法是半微量定糖法,操作简便、快速、杂质干扰较少。 4、各纯化级别蔗糖酶的蛋白质含量测定; Folin- 酚法(Lowry 法): 这是测定蛋白质含量最灵敏的经典方法之一,由于方法简便,灵敏度高,常为实验室所采用,也是文献上用得最多的方法之一。原理: A) 凡含有两个及两个以上肽键(-CO-NH-) 的化合物在碱性溶液中(如 Folin- 甲试剂) 都能与 Cu2+ 作用,形成紫色的复合物; B) 所有的蛋白质均可与 Folin- 甲试剂反应形成紫色的铜- 蛋白质复合物; C)铜- 蛋白质复合物在 pH=10 的碱性溶液中可将磷钼酸- 磷钨酸(Folin- 乙试剂) 还原成兰色的钼蓝和钨蓝混合物,其颜色的深浅( 在一定范围内) 与蛋白质的含量成正比。 5、蔗糖酶酶促反应动力学研究; 酶促反应动力学(ics of enzyme-catalyzed reaction ) 含义: 酶促反应动力学是研究酶促反应的速度以及影响此速度的各种因素的科学,是酶工程研究中的一个重要内容。影响酶促反应速度的因素 pH值、温度、酶浓度、底物浓度、激活剂、抑制剂 6、正交试验法测定不同条件对蔗糖酶活性的影响: 正交试验设计(Orthogonal experimental design) 是研究多因素多水平的一种设计方法, 它是从全面试验中挑选出部分有代表性的点进行试验,这些有代表性的点具备了“均匀分散, 齐整可比”的特点。是一种高效率、快速、经济的实验设计方法。日本著名的统计学家田口玄一将正交试验选择的水平组合列成表格,称为正交表。正交试验的提出考虑兼顾全面试验法和简单比较法的优点, 利用根据数学原理制作好的规格化表-正交表来设计试验不失为一种上策。用正交表来安排试验及分析试验结果,这种方法叫做正交试验法。正交试验法优点: 1 )试验点代表性强,试验次数少。 2 )不需做重复试验,就可以估计试验误差。 3 )可以分清因素的主次。 4 )可以使用数理统计的方法处理试验结果。正交试验(表)法的特点: 1 )均衡分散性─代表性。 2 )整齐可比性─可以用数理统计方法对试验结果进行处理。实验原理(总) 1 、蔗糖酶的提取细胞破壁:就酶在生物体内的分布,可分为胞内酶和胞外酶,蔗糖酶系胞内酶。提取胞内酶时, 要破碎组织和细胞, 然后用一定的溶液提取, 得到的材料称为无细胞抽提液。材