锁核酸分子信标的设计、合成及其性能探究.pdf

湖南大学
硕士学位论文
锁核酸分子信标的设计、合成及其性能研究
姓名:崔亮
申请学位级别:硕士
专业:生物化学与分子生物学
指导教师:羊小海;王柯敏
20090701
摘要��,��作为一种新型的核酸衍生物,具有亲和性高、热稳定性好、抗酶切能力强、体内无毒性等优点,并且可以像普通��引物一样采用固相法进行合成,因而被广泛地应用于反义治疗、单核苷酸多态性������,��检测等多个领域。基于锁核酸的上述优良性能,本文将其应用于分子信标的设计与合成中,有望提高分子信标的性能。主要开展了以下几方面的工作:��┒诵奘嗡�怂岱肿有疟甑纳杓啤⒑铣杉靶阅苎芯俊�设计、合成了一种茎部修饰锁核酸的新型分子信标,并通过荧光和色谱的方法考察了其抗酶切能力、杂交性能、热稳定性等。与常规分子信标相比,末端修饰锁核酸的分子信标抗酶切能力强,在与����饔玫某な奔淠诜肿有疟昙负�没有被降解;热稳定性好,在�℃的高温下仍然能够保持发夹状态;背景荧光信号低,提高了其杂交信背比;保持了分子信标的单碱基识别能力。这些性能将会拓展分子信标在复杂生物体系内的应用。��砼湮坏阈奘嗡�怂岱肿有疟甑纳杓啤⒑铣杉靶阅苎芯俊�设计、合成了在错配位点修饰�龊�个锁核酸的分子信标,通过荧光实验考察了其选择性、杂交信背比、热稳定性等。结果表明,在错配位点修饰锁核酸显著地提高分子信标的单碱基错配识别能力,但是随着锁核酸修饰数目的增加,其选择性并不会进一步提高。同时,锁核酸的修饰也提高了分子信标的信背比。熔解曲线表明,这种性能的提高是锁核酸的杂交亲和性高所致,因此具有通用性,将有助于分子信标在��觳饧暗头岫妊�分械募觳狻����胱犹匾煨运�怂岱肿有疟甑纳杓啤⒑铣杉靶阅苎芯俊�设计、合成了***离子选择性锁核酸分子信标,通过荧光实验考察锁核酸�甌碱基错配与***离子的结合能力,发现锁核酸�甌错配链也具有与***离子结合形成�瓾�保甌结构的性能,其检测下限可达到�.��,线性范围为�达到了常规分子信标的检测范围,且对***离子有良好的选择性。关键词:分子信标;锁核酸;脱氧核糖核酸酶�坏ゼ罨�砼洌还�胱�锁核酸�����.���,����颈。�貉�宦畚������
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本文常用英文缩略词表锁核酸分予信标的设计、合成及�性能研究
第�滦髀���分子信标的结构、原理及应用��.�肿有疟甑慕峁乖����年,���菪�峁沟奶岢觯�窍执�肿由�镅У��睦锍瘫��,�,自此对于核酸生物大分子的研究进入了一个崭新的时代。通过分子工程的手段,人们设计、合成了各种核酸分子探针并将其应用于生物学、医学的各个领域。在近年来出现的各种核酸分子探针中,分子信标���������琈��窍嗟蓖怀�的一种【�,其简单的结构与巧妙的设计使得它一出现,就成为核酸分子探针中一颗耀眼的明星,在相关领域得到了广泛的应用。本章将对分子信标的结构原理、设计、应用和展望做简要介绍,并在此基础上提出本论文的主要构想。���蚄�����坑���晔状伪ǖ懒朔肿有疟辍K�腔�谟ü夤舱衲芰�转移�����������,���窒笊杓频囊欢斡胩囟ê怂�互补的核酸探针。分子信标长约�.�个碱基,在空间结构上呈发夹状的茎环结构,其中环序列是与靶核酸互补的序列;茎长约��个碱基,由与靶序列无关的互补序列构成;茎的��撕�’端分别连有荧光基团和荧光淬灭基团。当无靶序列存在时,分子信标呈茎环结构,茎部的荧光分子与淬灭分子非常接近�.�发生��,荧光分子发出的荧光被淬灭分子吸收并以热的形式散发,此时检测不到荧光信号;当有靶序列存在时,分子信标的环序列与靶序列特异性结合,形成的双链体比分子信标的茎坏结构更稳定,荧光分子与淬灭分子分开,此时荧光分子发出的荧光不能被淬灭分子吸收,可检测到荧光,且所检测到的荧光强度与溶液中目标序列的量成正比。其工作原理如图��所示。