Taqman探针及SYBR Green I荧光染料技术.ppt

半定量RT-PCR原理
半定量RT-PCR是指通过总RNA逆转录为cDNA后,扩增目标cDNA和内参cDNA,通过PCR产物量推测样品中特异mRNA的相对数量。内参是基因组中保守的DNA序列,其表达恒定,因此在总RNA中所占的比例是大致恒定的。目标基因在受到处理因素影响后,其表达量一般有所改变。这样扩增后目标产物与内参产物量的比会有所变化,可以说明目标基因的表达量的改变,做到半定量!内参一般选用如:β-actin(β肌动蛋白),GAPDH(三磷酸甘油醛脱氢酶)等
步骤: ,,
注意: 步骤1,RNA抽提质量一定要好,注意污染。内参的选择,常用的有βactin和GAPDH俩中。步骤3,半定量RT-PCR应该再两管中进行,既内参和目的基因各一管,这样便于控制,做图的时候可以放在一各泳道里跑!指数期和平台期一定要摸清楚!
半定量RT-PCR步骤
TaqMan探针法是高度特异的定量PCR技术,其核心是利用Taq酶的3′→5′外切核酸酶活性,切断探针,产生荧光信号。由于探针与模板是特异性结合,所以荧光信号的强弱就代表了模板的数量。在TaqMan探针法的定量PCR反应体系中,包括一对PCR引物和一条探针。探针只与模板特异性地结合,其结合位点在两条引物之间。探针的5′端标记有报告基团(Reporter, R),如FAM、VIC等,3′端标记有荧光淬灭基团(Quencher, Q),如TAMRA等。当探针完整的时候,报告基团所发射的荧光能量被淬灭基团吸收,仪器检测不到信号。随着PCR的进行,Taq酶在链延伸过程中遇到与模板结合的探针,其3′→5′外切核酸酶活性就会将探针切断,报告基团远离淬灭基团,其能量不能被吸收,即产生荧光信号(图4)。所以,每经过一个PCR循环,荧光信号也和目的片段一样,有一个同步指数增长的过程。信号的强度就代表了模板DNA的拷贝数。
TaqMan探针法
TaqMan探针法
TaqMan探针根据其3′端标记的荧光淬灭基团的不同分为两种:普通的TaqMan探针和TaqMan MGB探针。MGB探针的淬灭基团采用非荧光淬灭基团(Non-Fluorescent Quencher),本身不产生荧光,可以大大降低本底信号的强度。同时探针上还连接有MGB (Minor Groove Binder)修饰基团(图5),可以将探针的Tm值提高10°C左右。因此为了获得同样的Tm值,MGB探针可以比普通TaqMan探针设计得更短,既降低了合成成本,也使得探针设计的成功率大为提高。因为在模板的DNA碱基组成不理想的情况下,短的探针比长的更容易设计。实验证明,TaqMan MGB探针对于富含A/T的模板