DNA测序技术.ppt

DNA测序技术简介
人类基因组计划(Human Genome Project-HGP)于1990年正式启动,其主要目标有:识别人类DNA中所有基因(超过10万个);测定组***类DNA的30亿碱基对的序列;将这些信息储存到数据库中;开发出有关数据分析工具;致力于解决该计划可能引发的伦理、法律和社会问题。
人类基因组计划是当代生命科学一项伟大的科学工程,它奠定了21世纪生命科学发展和现代医药生物技术产业化的基础,具有科学上的巨大意义和商业上的巨大价值。
造福人类的HGP:
中国的HGP起步较晚, 但中国人口众多,有56 个民族和许多遗传隔离群, 拥有世界上最丰富的遗传家系资源, 对于研究HGP的重要目标之一——人类遗传的多样性正具有得天独厚的优势。
拥有一批国家重点实验室及专业齐备的科研力量, 因此可以根据HGP的目标, 结合中国的特点开展研究。
1999年7月,我国在国际人类基因组注册,承担了其中1%的测序任务,此举标志着我国已掌握生命科学领域中最前沿的大片段基因组测序技术,在结构基因组学中占了一席之地。
我国与HGP:
DNA测序的方法
链终止法测序
化学降解法测序
自动化测序
非常规DNA测序
链终止法测序(the chain termination method)
ddNTP与普通dNTP不同之处在同它们在脱氧核糖的3' 位置缺少一个羟基。它们可以在DNA聚合酶作用下通过其5' 三磷酸基团掺入到正在增长的DNA链中,但由于没有3'羟基,它们不能同后续的dNTP形成磷酸二酯链,因此,正在增长的DNA链不可能继续延伸。这样,在DNA合成反应混合物的4种普通dNTP中加入少量的一种ddNTP后, 链延伸将与偶然发生但却十分特异的链终止展开竞争,反应产物是一系列的核苷酸链,其长度取决于从用以起始DNA合成的引物末端到出现过早链终止的位置之间的距离。在4组独立的酶反应中分别采用4种不同的ddNTP,结果将产生4组寡核苷酸,它们将分别终止于模板链的每一个A、每一个G或每一个T的位置上。
生成互相独立的若干组带放射性标记的寡核苷酸,每组寡核苷酸都有固定的起点,但却随机终止于特定的一种或者多种残基上。
由于DNA上的每一个碱基出现在可变终止端的机会均等,因此上述每一组产物都是一些寡核苷酸混合物,这些寡核苷酸的长度由某一种特定碱基在原DNA全片段上的位置所决定。
在可以区分长度仅差一个核苷酸的不同DNA分子的条件下,对各组寡核苷酸进行电泳分析,只要把几组寡核苷酸加样于测序凝胶中若干个相邻的泳道上,即可从凝胶的放射自影片上直接读出DNA上的核苷酸顺序。
方法概述:
脱氧核甘酸与双脱氧核苷酸结构比较
少一个-OH
技术路线与要求
制备单链模板
↓
将单链模板与一小段引物退火
↓
加入DNA多聚酶
4种脱氧核苷酸
分别加入少量4种双脱氧核苷酸
↓
将4种反应产物分别在4条泳道电泳
↓
根据4个碱基在4条泳道的终止位置读出基因序列
A 克隆于质粒中DNA→用碱或热变性
B M13克隆单链DNA
C 噬粒克隆DNA
D PCR产生单链DNA
A 高酶活性
B 无5’→3´外切酶活性
C 无3´→5´外切酶活性
ddATP/ddCTP/ddGTP/ddTTP 的3’碳原子连接的是氢原子,不是羟基
5ˊP
P 5ˊ
3ˊHO
OH 3ˊ
5ˊP
OH 3ˊ
P32 5ˊ
5ˊP
OH 3ˊ
HO
DNA聚合酶,dATP,dTTP,dGTP,dCTP
ddGTP
ddATP
ddTTP
ddCTP
制备单链DNA
加放射性引物