体外转录试剂盒说明书.doc

使用试剂盒时所有的试剂要放置在冰上
转录反应步骤和孵育
解冻冷冻的试剂
把RNA聚合酶混合物放置在冰上,它在甘油中保存,没有被保存在-20。
vortex10×reaction buffer和2×NTP/CAP至完全溶解,一旦解冻,反应过程中把 2×NTP/CAP放在冰上,10×reaction buffer保存在室温,
所有的试剂在打开之前都应该短暂的微微离心,以防丢失或污染到离心管边缘的物质。
室温下转录反应
如果反应在冰上进行,10×reaction buffer中的亚精***可以与模板中的DNA共沉淀,
离心管中加入水和核苷酸后再加入10×reaction buffer。
以下是一个20ul的反应体系,可按需要放大或缩小。
当RNA长度为300base-5kb时采用以下反应体系
(- PCR产物模板或0-1ug线性质粒模板)
对于更长或更短的转录,参考20页的“Optimizing yield of long transcripts’’和“Optimizing yield of short transcripts”部分。
当合成转录的长度大于5或6KB时,限制GTP生成率,会导致产量降低、过早终止转录。为了避免这种情况,可能需要补充额外的GTP支持反应。下面是添加特定体积的GTP对普通转录反应的影响。

(对于T7和T3试剂盒,提供的GTP为30mM。对于SP6,为20mM.)
应该添加多少额外的GTP?
对于5-8KB的长度,我们建议最初测试加入1ul的GTP,对于更长的模板应该试试滴定额外的GTP确定所需的最小值。添加GTP将减少转录合成加帽的比例,但将引起产量升高。加帽转录的比例与反应中GTP中CAP的模拟物的比率成正比。
RNA产量与良好的加帽效率之间的平衡
在网织红细胞溶解物中,我们测试了GTP不同比例的CAP模拟物对转录反应的RNA产量和产生RNA的翻译效率的影响。(表1)
网织红细胞球蛋白的RNA的翻译依赖于CAP。随着GTP的CAP模拟物增加,RNA的产量减少。相反,合成的RNA的翻译效率随着模拟物的比率增加而增加,这反映了5’端加帽的转录的增加。注意GTP的CAP模拟物为4:1时提供了一个很好的RNA产量和加帽效率的平衡。没有加帽的转录在爪蟾卵母细胞的显微注射实验中不会出现问题。这些未加帽的转录很可能迅速的被卵母细胞降解。
除了加入不同比率的m7G(5')ppp(5')G,T7-mMESSAGE mMACHINE 反应在标准条件下进行。使用1ug的T7球蛋白模板DNA 37度孵育1h。球蛋白RNA (6 µg/mL)在25ul的Retic Lysate IVT™进行翻译, µCi of [35S]蛋氨酸(1200 Ci/mmol),30°C反应 60 min 。测量TCA-可沉淀 cpm 的量。
彻底混匀
轻弹离心管或用移液器上下轻轻吹打混匀混合物,短暂低速离心,收集管底的反应混合物。
4. 37度孵育1hr
一般来说,孵育1h后可获得80%合成。对于最大化合成,建议孵育2h。由于SP6反应稍微慢于T3和 T7反应,它们尤其可能受益于第2h的孵育。
对于合成《300base的转录和转录效率低下的模板,建议第二个小时的孵育。
如果反应是示踪标记