圆形纸层析法鉴定转氨基作用的实验改进.doc

圆形纸层析法鉴定转氨基作用的实验改进.doc圆形纸层析法鉴定转氨基作用的实验改进
材料
新鲜猪肝组织1 g、1%谷氨酸溶液、1%***酸溶液、%碘乙酸溶液、%丙氨酸、 mol/L()磷酸盐缓冲液、%茚三***乙醇溶液、原展层剂(苯酚、水)、新展层剂(无水乙醇、水、尿素)。
实验方法
肝匀浆制备
取新鲜猪肝1 g置于研钵中研碎, mol/L()的磷酸盐缓冲液4 ml,磨成匀浆。
转氨基反应
取2支试管,分别标记为测定管和对照管,测定管内加入肝匀浆10滴,对照管内加入煮沸过的肝匀浆10滴,%碘乙酸5滴、1%谷氨酸10滴、1%***酸钠10滴,在40 ℃水浴箱中保温10 min,加入5%三***醋酸2滴,最后在沸水中加热5 min冷却后,离心5 min,取上清液备用。
标记划线
取圆形滤纸(直径12 cm)8张,用铅笔从圆心画长度各1 cm的端点作为点样处,在各点对应的滤纸边缘标上“谷”、“丙”、“对”、“测”字样。
点样
取4根毛细管,用顶端分别沾取测定管、对照管、%谷氨酸、%丙氨酸样品液,在滤纸相应点样处点样,每处点2次。
层析和显色
在8个直径为5 cm的表面皿中分别加入4种不同的展层剂,即苯酚∶水(4∶1)和无水乙醇∶水∶尿素(分别为:80∶20∶、70∶30∶、60∶40∶),每种展层剂平行做两份。将表面皿置于直径为10cm培养皿正中,把滤纸平放在培养皿上,使灯芯浸入展层溶剂中,取另一同样大小的培养皿反向盖上,溶剂将沿灯芯上升到滤纸,并向四周扩散,待溶剂前沿扩散至滤纸边缘约1 cm时,取出滤纸,用铅笔划出溶剂前后,在烤箱中烤干。由于无水乙醇∶水∶尿素展层剂中直接加入了茚三***,故从烤箱中取出的6张滤纸上有紫色的弧形色斑;而原配方的展层剂中没有加入茚三***,%茚三***乙醇溶液,再放入烤箱中第二次烤干,才出现紫色的弧形色斑。用铅笔描出色斑轮廓, 计算迁移率Rf值,取两份平行结果的平均值。
2 结果
经过转氨基作用后,谷氨酸与丙氨酸在四种展层剂中的迁移率见表1。从8张滤纸的层析图谱结果看到,苯酚∶水和乙醇∶水∶尿素(80∶20∶)这4张滤纸上,氨基酸分离效果较为明显,而乙醇∶水∶尿素(70∶30∶)和乙醇∶水∶尿素(60∶40∶)这4张滤纸的氨基酸无法分离。表1 两种氨基酸在四种配方中的迁移率(略)
3 讨论
纸层析图谱和迁移率

从4张能分离氨基酸的纸层析图谱结果可以看到,对照管中没有发生转氨基作用,只有一个色斑,而测定管中发生了转氨基作用,有两个色斑。
从谷氨酸和丙氨酸的点样色斑相比较得出,距点样处近的是谷氨酸,距点样处远的是丙氨酸。4张纸层析图谱的色斑都分得很明显,证明新旧两种配方的展层剂均能较好的分离氨基酸。从表1的结果也可看到,通过两种不同配方的展层剂分离出来的氨基酸迁移率基本相同,说明用新配方制成的展层剂也能达到分离氨基酸的目的,而且效果很好。
新展层剂中使用乙醇的优点

新展层剂的成分为乙醇、水和尿素,比较原有的展层剂,新配方具有以下几个优点