NF-κB参与小鼠Hepcidin基因转录调控的实验研究.pdf

第三军医大学
硕士学位论文
NF-κB参与小鼠Hepcidin基因转录调控的实验研究
姓名:廖荣霞
申请学位级别:硕士
专业:生物化学与分子生物学
指导教师:周建新
20040501
第三军医大学硕士学位论文
ê 参与小鼠基因转录调控的实验研究

摘要

Hepcidin(肝杀菌肽 HEPC)是新近发现的第一种由哺乳动物肝脏特异表达的抗菌
肽属于富含半胱氨酸的阳离子抗菌肽具有广谱抗菌活性从鱼类到人类的众多脊椎
动物肝脏中均检测到其同源基因具有很高的保守性同时 Hepcidin 在维持铁代谢平
衡中起着关键性的调控作用参与多种铁代谢疾病的发病机制 Hepcidin 的双重作用
引起广泛的研究兴趣人们希望实现对 Hepcidin 基因表达的准确控制为建立以
Hepcidin 为靶点的各种铁代谢紊乱疾病的新疗法提供实验依据从而引发了对参与调控
Hepcidin 表达的分子的关注研究表明 Hepcidin 属于 II 型急性时相反应蛋白其启
动子区域存在 HNF3 肝核因子 C/AAT/增强子结合蛋白) NF- B 核
因子 B 等转录因子结合位点虽已证明 C/EBP 可能参与 Hepcidin 的转录调控仍
需进一步探讨其它转录因子在 Hepcidin 基因表达调控中的作用途径及效果
以下证据强烈提示 NF- B 可能参与 Hepcidin 急性时相表达的转录调控
从鱼类到小鼠到人类的 Hepcidin 基因的启动子区域存在 NF- B 的结合位点
呈高度保守 Hepcidin 作为 II 型急性时相反应蛋白其表达在炎症介质的诱导下明显
上调如 LPS 脂多糖和松节油
NF- B 与多种急慢性炎症的发展有关炎症介质(如 LPS)刺激引起 NF- B 的活
化与特定的 DNA 序列结合发挥其对基因转录的调控作用
NF- B 活化与肝脏中铁的积聚有密切关系而肝脏铁过量本身是诱导 Hepcidin
表达升高的原因 NF- B 可能在肝铁超载激发 Hepcidin 过度表达信号通路发挥作用
肝脏肿瘤的发生发展与 NF- B 表达密切相关而肝腺瘤表达大量的 Hepcidin
是否与 NF- B 参与 Hepcidin 转录调控相关呢
由此我们设计合成 Hepcidin 启动子区域 NF- B 结合位点探针研究 NF- B 参
与 Hepcidin 基因调控的可能性及其分子机制
目前研究 NF- B 调控靶基因表达常用的研究手段是电泳迁移率改变实验
(EMSA) 确定是否具有与转录因子结合的作用位点 South-western 确定探针结合的
转录因子的分子量抗体超迁法研究是哪个亚基在转录调控中发挥主要作用这些
技术方法成熟规范但仍存在不足如实验结果不能最终确定该转录因子的确是
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靶基因的转录调控分子缺乏细胞水平或体内实验的进一步验证因此如能特异
性阻断转录因子表达再检测受调控的靶基因是否发生改变就能验证上述实验结果
RNA 干涉(RNAi)技术阻断基因表达具有高稳定高效率和高特异的特点是当前研究
基因功能最有力的工具之一利用 RNAi 技术特异阻断 NF- B 的表达在细胞水平
分析验证 NF- B 对 Hepcidin 的转录调控作用并研究其分子机制是本课题的出发点
研究目的
探讨转录因子 NF- B 参与 Hepcidin 基因急性时相表达的转录调控的可能性`
分析 NF- B 参与 Hepcidin 基因转录调控的分子机制
研究内容和方法
一急性时相反应小鼠模型的建立及 NF- B 参与 Hepcidin 基因转录调控研究
1 小鼠急性时相反应模型的建立
小鼠腹腔注射 LPS 诱导急性时相反应引颈处死小鼠取肝脏提取总 RNA
采用 RT-PCR 和 Northern blot 方法检测 Hepcidin 表达与 LPS 注射的时效剂效关系
并于各剂效点挖眼取血检测血清铁含量分析 Hepcidin 急性时相诱导表达的特点及
其与血清铁含量的关系
2 EMSA 法初步探讨 NF- B 参与 Hepcidin 基因转录调控的可能性
建立急性时相反应小鼠模型引颈处死小鼠取肝脏提取核蛋白设计合成
Hepcidin 上游调控序列 NF-КB 结合位点双链探针以 3'末端填平法标记 EMSA 法
分析 NF- B 对 Hepcidin 基因转录调控
二 NF- B 基因沉默研究 NF-КB 调控 Hepcidin 表达的分子机制
1 小鼠肝细胞的原代培养
取 5 周龄昆明小鼠肝组织采用组织块培养法/酶消化法进行肝细胞的原代培养
通过检测