酵母中蔗糖酶提取.docx

实验 酵母蔗糖酶的提取
一、实验目的:
1、学****酶的纯化方法,酶蛋白分离提纯的原理。
2、学****掌握细胞破壁、有机溶剂分级、透析和离子交换柱层析技术及分子筛层析技术。
3、学****独立设计实验应遵循的原则
二、实验原理:
蔗糖酶主要存在于酵母中, 但工业上通常从酵母中制取。 酵母蔗糖酶系胞内酶, 提取时细胞
破碎或菌体自溶。常用的提纯方法有盐析、有机溶剂沉淀、离子交换和凝胶柱层析。以此可
得到较高纯度的酶。
细胞破壁的几种方法
1、高速组织捣碎:将材料配成稀糊状液,放置于筒内约 1/3 体积,盖紧筒盖,将调速器先
拨至最慢处,开动开关后,逐步加速至所需速度。
2、玻璃匀浆器匀浆:先将剪碎的组织置于管中,再套入研杆来回研磨,上下移动,即可将
细胞研碎,此法细胞破碎程度比高速组织捣碎机为高,适用于量少和动物脏器组织。
3、反复冻融法:将细胞在 -20 度以下冰冻,室温融解,反复几次,由于细胞内冰粒形成和
剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀,使细胞结构破碎。
4、超声波处理法:用一定功率的超声波处理细胞悬液,使细胞急剧震荡破裂,此法多适用
于微生物材料。
5、化学处理法:有些动物细胞,例如肿瘤细胞可采用十二烷基磺酸钠( SDS)、去氧胆酸钠
等细胞膜破坏,细菌细胞壁较厚,可采用溶菌酶处理效果更好。
有机溶剂沉淀法即向水溶液中加入一定量的亲水性的有机溶剂可降低溶质的溶解度使其沉
淀被析出。
三、试剂:
啤酒酵母 、 二氧化硅 、甲苯(使用前预冷到 0℃以下)、去离子水(使用前冷至 4℃左
右)、 1mol / L 醋酸 、 95%乙醇
四、仪器:
研钵 1 个、离心管 3 个 、 3. 滴管 3 个、量筒 50ml 1 个、水浴锅 1 个、恒温水浴、 烧杯 100ml
2 个、广泛 pH 试纸、高速冷冻离心机
四、操作步骤:
1. 提取
(1)准备一个冰浴,将研钵稳妥放入冰浴中。预先在冰箱中冷却 20g 干酵母和 10g 二氧化
硅。
(2)将 20g 干酵母粉和 10g 二氧化硅,放入研钵中。量取预冷的甲苯 30ml 缓慢加入酵母
中,边加边研磨成糊状,约需 60 分钟。研磨时用显微镜检查研磨的效果,至酵母细胞大部
分研碎。
(3)缓慢加入预冷的 40ml 去离子水,每次加 2ml 左右,边加边研磨,至少用 30 分钟。以
便将蔗糖酶充分转入水相。
(4)缓慢加入预冷的 40ml 去离子水,每次加 2ml 左右,边加边研磨,至少用 30 分钟。以
便将蔗糖酶充分转入水相。
( 5)将混合物转入两个离心管中, 平衡后, 用高速冷离心机离心, 4℃,10000rpm ,10min 。
如果中间白色的脂肪层厚,说明研磨效果良好。用滴管吸出上层有机相。
( 6)用滴管小心地取出脂肪层下面的水相, 转入另一个清洁的离心管中, 4℃,10000rpm ,
离心 10min 。
( 7)将清液转入量筒,量出体积,留出  测定酶活力及蛋白含量。剩余部分转入清
洁离心管中。
( 8)用 pH 试纸检查清液 pH,用 1mol / L 醋酸将 pH 调至  ,称为“粗级分 I”。
( 4)取沉淀研磨液上清液倒入小烧杯中,洗涤沉淀两次,把洗涤上清液倒入小烧杯中,
分别把三个上清液