考马斯亮蓝 法测定蛋白质含量.doc

二、Bradford法
(一)、原理:
考马斯亮蓝G250 ( CBB- G-250)与蛋白质结合后形成蓝色的化合物,在595nm有最大吸收峰,且蓝色的深浅与蛋白浓度成正比。这是一种快速、准确、重复性好的蛋白质定量方法。
该方法快速、准确、干扰因素少。CBB- G-250在2分钟内即可完全与蛋白结合,并在2小时内保持稳定,该反应几乎不受钠、钾等阳离子的干扰,更不受蔗糖等碳水化合物的干扰。但较高浓度的十二烷基硫酸钠(Soldium dodecyl sulfate),Triton X-100等对其有干扰,此影响可通过选择适当的对照品来消除。
(二)器材及试剂
1、器材
A. 分光光度计
B. 微量加样器
C. 移液管、试管及试管架
D. 坐标纸
2. 试剂
(1)考马斯亮蓝G-250溶液:
称取CBB- G-250 100毫克溶于 50 ml 95%(V/V)乙醇溶液中,然后加入100毫升 85%(V/V) 磷酸,最后加蒸馏水定容至1000毫升。
(2) ***化钠溶液(生理盐水)
(3)标准蛋白质溶液():
,用生理盐水定容至100毫升。
(4) 血清样品(已稀释200倍)
(5) 层析样品
(三)、操作(标准曲线制作) :
取7支试管按下表操作:
空白
待测
标1
标2
标3
标4
标5
标准蛋白(ml)





待测样品2(ml)

生理盐水(ml)







CBB-G250(ml)







最终蛋白浓度(ug/ml)






混匀,室温放置5分钟,,.
以Bradford法测定层析分离蛋白内的蛋白浓度
,加入生理盐水20ul,最后加入考马斯亮蓝G-,混匀,以595nm 波长测定二者光密度,在标准曲线上查出其蛋白浓度
以上需要购买的试剂有:1、标准蛋白质即牛血清白蛋白。
教学内容:
实验八考马斯亮蓝法(Bradford法)测定蛋白质含量
【实验目的】
1. 掌握考马斯亮蓝染色法定量测定蛋白质的原理与方法
2. 熟练分光光度计的使用和操作方法
【实验原理】
    此方法是1976年Bradform建立。考马氏亮蓝G-250在酸性溶液中为棕红色,当它与蛋白质结合后,变成蓝色,最大吸收波长从465nm转移到595nm处,在一定的范围内,蛋白质含量与595nm的吸光度成正比。
【器材与试剂】
器材 2. 刻度移液管 4. 新鲜小麦叶片或绿豆芽下胚轴等
试剂 1. %生理盐水
2. 考马斯亮蓝试剂 
称取CBB- G-250 100毫克溶于 50 ml 95%(V/V)乙醇溶液中,然后加入100毫升 85%(V/V) 磷酸,最后加蒸馏水定容至1000毫升。
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