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考马斯亮蓝法测定蛋白质含量.ppt

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:掌握考马斯亮蓝G-250染色法测定蛋白质的原理和操作;了解分光光度法测定蛋白质的几种方法;进一步熟悉分光光度计的使用。二、原理分光光度法测定蛋白质的几种方法1、双缩脲法:在碱性条件下,蛋白质能与铜离子结合形成紫红色络合物,540nm,1-10g/L。与蛋白质的相对分子量及氨基酸组成无关,快速,不受硫酸铵干扰。灵敏度低,需要样品量大;2、Folin-酚试剂法(Lowry法):在碱性条件下,蛋白质首先与铜离子形成紫红色络合物,该络合物以及Tyr,Trp残基还原Folin试剂,产生深蓝色。750nm,-3g/L或500nm,-。灵敏度高,需要样品量少;但干扰因素多,操作试剂配制麻烦,不同蛋白质之间差异大。3、考马斯亮蓝染色法:在酸性环境下,棕红色的考马斯亮蓝与蛋白质通过疏水力相结合,蓝色化合物,595nm,颜色深浅与蛋白质含量成正比。-1g/L,灵敏度高,需要样品量少,不同蛋白质之间差异大。4、紫外分光光度法:280nm,不同蛋白质之间差异大三、仪器721分光光度计(使用前预热20min);移液管:四、实验试剂标准蛋白质溶液:;染色液(考马斯亮蓝G-250溶液):-250,溶于50mL90%乙醇中,加入85%的磷酸100mL,蒸馏水定容到1000mL,贮放在棕色瓶中,此溶液在常温下可放置1个月。、标准曲线(蛋白质含量为0~)的绘制:利用1,2,3,4,5,6号试管数据绘制。1号试管调零。2、样品提取液中蛋白质浓度的测定7,8好试管数据取平均值。试管号12345678蛋白质

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