实验二细菌涂(抹)片的制备和革兰氏染色
目的要求:1、掌握细菌抹片的制备方法和常用染色方法。 2、认识革兰氏染色和抗酸性染色的反应特性。
实验内容:
1、 细菌抹片的制备:
玻片准备:透明、洁净、无油渍。
抹片:液体材料、非液体材料、组织脏器材料的抹片方法讲解、示范。
干燥固定:火焰固定和化学固定的示范。讲解其目的及注意事项。
2、 细菌涂片的制备:讲解并示范涂片、干燥、固定的方法。
3、 细菌常用染色方法:革兰氏染色法
细菌抹片的制备
革兰氏染色法:1. 制片:取待检病料或细菌培养物常规抹(涂)片、干燥、固定。2. 初染:滴加结晶紫,染色1-2分钟,水洗。3. 媒染:用碘液冲去残水,并用碘液覆盖约1分钟,水洗。4. 脱色:用滤纸吸取或甩去载玻片上的残水,将载玻片倾斜,在白色背景下,用滴管流加95%乙醇脱色,直至流出的乙醇无紫色时(20—30秒),立即水洗。
:用复红液复染约2分钟,水洗。6. 镜检:用滤纸吸水,干燥后,显微镜油镜观察。
革兰氏染色法原理: 革兰氏染色法将细菌分为G+和G- ,这由两类细菌细胞壁的结构和组成的不同而决定。用结晶紫初染后,所有的细菌都染上蓝紫色。碘作为媒染剂能与结晶紫结合形成结晶紫-碘的复合物,增强了染料与菌体的结合力。用乙醇脱色处理时,两类细菌的脱色效果是不同的。G+细菌的细胞壁主要由肽聚糖形成的网状结构组成,且壁厚、类脂含量低,用乙醇脱色时使细胞壁脱水、网状结构孔径缩小,通透性降低,使得结晶紫—碘的复合物不易被洗脱而保留在细胞内。虽经洗脱和复染仍然保持初染剂的蓝紫色。G-细菌则不同,由于其细胞壁肽聚糖层较薄,类脂含量高,所以在脱色处理时,类脂被乙醇溶解,细胞壁的通透性增大,使结晶紫—碘的复合物比较容易被洗脱出来,用复染剂复染后,细胞被染上复染剂的颜色。
G+菌与G-菌细胞壁的区别
细胞壁革兰阳性菌革兰阴性菌
强度较坚韧较疏松
厚度 21~80nm 10~15nm
肽聚糖层可达50 层 1~2层
肽聚糖量 50%~80% 5 %~80%
糖类量约45% 15%~20%
脂类量 1%~4% 11~22%
磷壁酸﹢﹣
外膜﹣﹢
革兰氏染色法过程示意图
革兰氏染色法动画
革兰阳性菌革兰阴性菌
革兰氏染色法
革兰氏染色法动画
实验报告:1、细菌抹片或涂片革兰氏染色的显微镜观察结果。2、革兰氏染色法的具体程序和注意事项。
涂片
干燥
固定
染色1~2min
水洗、吸干
镜检
细菌的单染色
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