实验一-3-5-二硝基水杨酸比色法-还原糖和总糖的测定.doc

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掌握还原糖和总糖测定的基本原理,学****比色法测定还原糖的操作方法和分光光度计的使用。
二、实验原理
还原糖的测定是糖定量测定的基本方法。还原糖是指含有自由醛基或***基的糖类,单糖都是还原糖,双糖和多糖不一定是还原糖,其中乳糖和麦芽糖是还原糖,蔗糖和淀粉是非还原糖。利用糖的溶解度不同,可将植物样品中的单糖、双糖和多糖分别提取出来,对没有还原性的双糖和多糖,可用酸水解法使其降解成有还原性的单糖进行测定,再分别求出样品中还原糖和总糖的含量(还原糖以葡萄糖含量计)。
还原糖在碱性条件下加热被氧化成糖酸及其它产物,3,5-二硝基水杨酸则被还原为棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸。在一定范围内,还原糖的量与棕红色物质颜色的深浅成正比关系,利用分光光度计,在540nm波长下测定光密度值,查对标准曲线并计算,便可求出样品中还原糖和总糖的含量。由于多糖水解为单糖时,每断裂一个糖苷键需加入一分子水,。

三、实验材料、主要仪器和试剂
1. 实验材料
小麦面粉;广范pH试纸。
2. 主要仪器
(1)大试管:2×20cm×14
(2)烧杯:100mL×3
(3)三角瓶:100mL×1
(4)容量瓶:100mL×3
(5)移液管:1mL×3;2mL×2;10mL×4
(6)吸耳球、玻璃棒
(7)恒温水浴锅
(8)漏斗、滤纸
(9)白瓷缸、电炉
(10)精度天平
(11)分光光度计
3. 试剂(已制备)
(1)1mg/mL葡萄糖标准液
准确称取90℃烘至恒重的分析纯葡萄糖100mg,置于小烧杯中,加少量蒸馏水溶解后,转移到100mL容量瓶中,用蒸馏水定容至100mL,混匀,4℃冰箱中保存备用。
(2)3,5-二硝基水杨酸(DNS)试剂
3,5-二硝基水杨酸(DNS)和2mol\L NaOH溶液262mL,加到500mL含有185g酒石酸钾钠的热水溶液中,再加5g重蒸酚和5g亚硫酸钠,搅拌溶解,冷却后加蒸馏水定容至1000mL,贮于棕色瓶中,7-10天后才能使用。
(3)6mol/L HCl和6mol/L NaOH 。
四、操作步骤
1. 制作葡萄糖标准曲线
取7支2×20cm大试管编号,按表1分别加入浓度为1mg/mL的葡萄糖标准液、蒸馏水和3,5-二硝基水杨酸(DNS)试剂,配成不同葡萄糖含量的反应液。
表1 葡萄糖标准曲线制作
管号
葡萄糖含量
(mg)
1mg/mL葡萄糖标准液
(mL)
蒸馏水
(mL)
DNS
(mL)
吸光度值
(A540)
0
0
0
2

 
1




 
2




 
3




 
4




 
5




 
6




 
将各管摇匀,在沸水浴中准确加热5min,取出,用流动水冷却至室温,用蒸馏水补充至20mL(),震荡混匀,在分光光度计上进行比色。调波长540nm,用0号管调零点,测出1~6号管的吸光度值。以吸光度值为纵坐标,葡萄糖含量(