实验一 还原糖和总糖的测定-3,5-二硝基水杨酸比色法.doc

实验一还原糖和总糖的测定—— 3,5- 二硝基水杨酸比色法一、目的与要求掌握还原糖和总糖测定的基本原理, 学****比色法测定还原糖的操作方法和分光光度计的使用。二、实验原理还原糖的测定是糖定量测定的基本方法。还原糖是指含有自由醛基或***基的糖类, 单糖都是还原糖, 双糖和多糖不一定是还原糖, 如乳糖和麦芽糖是还原糖, 蔗糖和淀粉是非还原糖。利用糖的溶解度不同, 可将植物样品中的单糖、双糖和多糖分别提取出来, 对没有还原性的双糖和多糖, 可用酸水解法使其降解成有还原性的单糖进行测定, 再分别求出样品中还原糖和总糖的含量(还原糖以葡萄糖含量计)。还原糖在碱性条件下加热被氧化成糖酸及其它产物, 3,5- 二硝基水杨酸则被还原为棕红色的 3- 氨基-5- 硝基水杨酸。在一定范围内,还原糖的量与棕红色物质颜色的深浅成正比关系,利用分光光度计,在 540 nm 波长下测定光密度值,查对标准曲线并计算,便可求出样品中还原糖和总糖的含量。由于多糖水解为单糖时,每断裂一个糖苷键需加入一分子水,所以在计算多糖含量时应乘以 。三、实验材料、主要仪器和试剂 1 .实验材料小麦面粉(1000 g) 2. 主要仪器(1) 具塞玻璃刻度试管: 20 mL × 11(2) 滤纸(3) 烧杯: 100 mL × 2(4) 三角瓶: 100 mL ×1(5) 容量瓶: 100 mL ×3(6) 刻度吸管: 1mL ×1;2 mL ×2; 10 mL ×1(7 )恒温水浴锅(8 )煤气炉(9 )漏斗( 10 )天平( 11 )分光光度计 3. 试剂(1) 1mg/mL 葡萄糖标准液准确称取 80℃烘至恒重的分析纯葡萄糖 100 mg , 置于小烧杯中, 加少量蒸馏水溶解后, 转移到 100 mL 容量瓶中,用蒸馏水定容至 100 mL ,混匀, 4℃冰箱中保存备用。(2) 3,5- 二硝基水杨酸( DNS )试剂 3,5 -二硝基水杨酸( DNS )试剂:称取 g DNS 溶于少量热蒸馏水中,溶解后移入 1000 mL 容量瓶中,加入 2 mol/L 氢氧化钠溶液 325 mL ,再加入 45g 丙三醇,摇匀,冷却后定容至 1000 mL 。(3 )碘- 碘化钾溶液:称取 5g 碘和 10g 碘化钾,溶于 100 mL 蒸馏水中。(4 )酚酞指示剂:称取 g 酚酞,溶于 250 mL 70% 乙醇中。(5)6M HCl 和6M NaOH 各 100 mL 。(分别取 mL 37% 浓盐酸和 24克 NaO H 定容至 100mL ) 四、操作步骤 1. 制作葡萄糖标准曲线取7支 20 mL 具塞刻度试管编号,按表 1 分别加入浓度为 1 mg/mL 的葡萄糖标准液、蒸馏水和 3,5- 二硝基水杨酸( DNS )试剂,配成不同葡萄糖含量的反应液。表 1葡萄糖标准曲线制作管号 1mg/mL 葡萄糖标准液( mL ) 蒸馏水( mL ) DNS ( mL ) 葡萄糖含量( mg ) 光密度值( OD ? 540nm ) 002 1 2 3 4 5 6 将各管摇匀,