实验一 还原糖和总糖的测定-3,5-二硝基水杨酸比色法.doc

实验一还原糖和总糖的测定——3,5-二硝基水杨酸比色法
一、目的与要求
掌握还原糖和总糖测定的基本原理,学****比色法测定还原糖的操作方法和分光光度计的使用。
二、实验原理
还原糖的测定是糖定量测定的基本方法。还原糖是指含有自由醛基或***基的糖类,单糖都是还原糖,双糖和多糖不一定是还原糖,如乳糖和麦芽糖是还原糖,蔗糖和淀粉是非还原糖。利用糖的溶解度不同,可将植物样品中的单糖、双糖和多糖分别提取出来,对没有还原性的双糖和多糖,可用酸水解法使其降解成有还原性的单糖进行测定,再分别求出样品中还原糖和总糖的含量(还原糖以葡萄糖含量计)。
还原糖在碱性条件下加热被氧化成糖酸及其它产物,3,5-二硝基水杨酸则被还原为棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸。在一定范围内,还原糖的量与棕红色物质颜色的深浅成正比关系,利用分光光度计,在540 nm波长下测定光密度值,查对标准曲线并计算,便可求出样品中还原糖和总糖的含量。由于多糖水解为单糖时,每断裂一个糖苷键需加入一分子水,。
三、实验材料、主要仪器和试剂
(1000 g)
(1)具塞玻璃刻度试管:20 mL×11 (2) 滤纸(3)烧杯:100 mL×2 (4)三角瓶:100 mL×1 (5)容量瓶:100 mL×3 (6)刻度吸管:1mL×1;2 mL×2;10 mL×1 (7)恒温水浴锅(8)煤气炉(9)漏斗(10)天平(11)分光光度计
3. 试剂
(1)1mg/mL葡萄糖标准液
准确称取80 ℃烘至恒重的分析纯葡萄糖100 mg,置于小烧杯中,加少量蒸馏水溶解后,转移到100 mL容量瓶中,用蒸馏水定容至100 mL,混匀,4℃冰箱中保存备用。
(2)3,5-二硝基水杨酸(DNS)试剂
3,5-二硝基水杨酸(DNS)试剂: g DNS溶于少量热蒸馏水中,溶解后移入1000 mL容量瓶中,加入2 mol/L氢氧化钠溶液325 mL,再加入45 g丙三醇,摇匀,冷却后定容至1000 mL。
(3)碘-碘化钾溶液:称取5 g碘和10 g碘化钾,溶于100 mL蒸馏水中。
(4)酚酞指示剂: g酚酞,溶于250 mL 70%乙醇中。
(5)6 M HCl和6 M NaOH各100 mL。( mL 37 %浓盐酸和24克NaOH定容至100mL)
四、操作步骤
1. 制作葡萄糖标准曲线
取7支20 mL具塞刻度试管编号,按表1分别加入浓度为1 mg/mL的葡萄糖标准液、蒸馏水和3,5-二硝基水杨酸(DNS)试剂,配成不同葡萄糖含量的反应液。
表1 葡萄糖标准曲线制作
管号
1mg/mL葡萄糖标准液(mL)
蒸馏水(mL)
DNS(mL)
葡萄糖含量(mg)
光密度值(OD540nm)
0
0
2

0
 
1




 
2




 
3




 
4




 
5




 
6




 
将各管摇匀,在沸水浴中准确加热5 min,取