解剖果蝇的方法.docx

实验方法:S的解剖:果蝇的准备选取所需年龄、基因型的果蝇2~4只,放置到通有持续性CO2的平台上,在体视镜下出去翅膀和腿,并切去腹部下段。注意:操作时要小心,以免扯坏胸节内的组织。固定从-20℃取出将先前分装好的4%PFA,在室温下待其充分溶解,,并在管壁上标上基因型和日期。将前面处理的果蝇按基因型放到EP管中固定30~60min。清洗待固定好后,3000rpm离心3min,吸去EP管上层的PFA固定液,,3000rpm离心3min,弃去上层液体,,3000rpm离心3min,弃去上层液体,这一次要在管底少量液体。解剖在垫有硅胶的培养皿中,加入适量PBS缓冲液。将果蝇从EP管倒出至培养皿。用镊子将果蝇按压到皿底,小心赶走气泡。慢慢将镊子移至胸节部位,沿着腿的根部,轻轻撕开角质膜,使乳白色的胸节神经索(VentralGanglion,VG)暴露。沿着撕开的部位向下滑动镊子,使VG的三节都暴露出来。注意:一定要静下心慢慢解,不要碰VG,以免其破损。用镊子拔去果蝇的口器,此时其乳白色的脑组织就会暴露出来。将镊子探入一侧opticlobe,小心扯去包裹在其上面的角质膜,另一半也同样操作。小心清除脑组织外面的气管和其他脏东西。注意:扯角质膜的力不能太大,以免brain被扯破;清除气管时一定要小心,不要将brain弄坏。S转移到装有PFA的EP管上后固定1~3h,然后用PBS缓冲液清洗三遍,每次10~15min。S在加有1%Triton的PBS缓冲液(以下简称为PBST)中处理30min,以增加抗体的穿透性。注意:在染Aβ时,在打孔前要先用70%S,使Aβ的抗原决定簇更多地暴露出来。封闭弃去PBST,加入适量3%BSA,处理1h,以封闭非特异性结合位点。孵育一抗弃去BSA,将一抗(如6E10,抗Aβ的抗体)以1:100的比例在BSA中稀释后,加到EP管盖上,放置到35mm培养皿做的湿盒,放到4℃冰箱孵育过夜。孵育二抗弃去一抗的孵育液,用PBST洗三遍,然后加入以1:100的比例在BSA中稀释的二抗,放置到35mm培养皿做的湿盒,放到4℃冰箱孵育过夜。注意:为了防止荧光淬灭,要在培养皿外面包上锡箔纸。PI(PropidiumIodide)染核弃去二抗的孵育液,用PBST洗三遍,然后加入以1:100的比例在BSA中稀释的PI,处理30min,然后用PBST洗三遍。封片用无水乙醇浸洗载玻片和盖玻片,晾干,并在载玻片上标记果蝇的基因型和日期。取几片盖玻片,用金刚石笔切割成长条状,以搭成放载玻片的小台,从而避免样品被压扁。S吸出,滴到载玻片的适当位置,并在体视镜下调整其姿态和位置,晾干。将盖玻片长条摆到样品的两侧,然后在其附近滴加封片剂,以防止荧光不正常淬灭。以合适的角度盖上盖玻片,尽量样品所在位置不要有气泡。在盖玻片周围涂