DNS比色法测定还原糖和总糖.docx

乳粉中还原糖的测定(3,5-二硝基水杨酸比色法)一、实验目的1、掌握还原糖和总糖测定的基本原理2、学****比色法测定还原糖的操作方法和分光光度计的使用二、实验原理还原糖的测定是糖定量测定的基本方法。还原糖是指含有自由醛基或***基的糖类。单糖都是还原糖,双糖和多糖不一定是还原糖,例如乳糖和麦芽糖是还原糖,蔗糖和淀粉是非还原糖。利用各种糖的溶解度不同,可将植物样品中的单糖、双糖和多糖分别提取出来。对非还原性的双糖和多糖,可用酸水解法使其降解成还原性单糖进行测定,再分别求出样品中还原糖和总糖的含量(常以葡萄糖含量计)。还原糖在碱性条件下加热可被氧化成糖酸及其它产物,而氧化剂3,5-二硝基水杨酸则被还原为棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸。在一定范围内,还原糖的量与棕红色物质颜色的深浅成正比关系,利用分光光度计在540nm波长下测定光密度值,查对标准曲线并计算,便可求出样品中还原糖和总糖的含量。由于多糖水解为单糖时,每断裂一个糖苷键需加入一分子水,。三、实验材料和试剂1、实验材料乳粉2、实验试剂①1mg/ml葡萄糖标准液准确称取95℃烘至恒重的分析纯葡萄糖100mg,置于小烧杯中,加少量蒸馏水溶解后,转移到100ml容量瓶中,用蒸馏水定容至100ml,混匀,4℃冰箱中保存备用。②3,5-二硝基水杨酸(DNS),加到500ml含有185g酒石酸钾钠的热水溶液中,再加5g结晶酚和5g亚硫酸钠,搅拌溶解,冷却后加蒸馏水定容至1000ml,贮于棕色瓶中备用。③乙酸锌溶液:,加3mL冰乙酸,加水溶解并稀释至100mL。④亚铁***化钾溶液:***化钾,加水溶解并稀释至100mL。四、实验器材比色管:25ml×9烧杯:100ml×1容量瓶:100ml×3刻度吸管:1ml×1;5ml×2;10ml×1恒温水浴锅天平分光光度计五、操作步骤1、制作葡萄糖标准曲线取7支比色管编号,按表1分别加入浓度为1mg/ml的葡萄糖标准液、蒸馏水和DNS试剂,配成不同浓度的葡萄糖反应液。表1葡萄糖标准曲线制作管号1mg/ml葡萄糖标准液(ml)蒸馏水(ml)DNS(ml)葡萄糖含量(mg)光密度值(OD-540nm),在沸水浴中准确加热5min取出,冷却至室温,用蒸馏水补足至10ml,加塞后混匀,在分光光度计上进行比色。调波长540nm,用0号管调零点,分别测出1~6号管的光密度值。以光密度值为纵坐标,葡萄糖含量(mg)为横坐标,在坐标纸上绘出标准曲线。2、样品中还原糖的测定①-,放入100ml烧杯中,先用少量蒸馏水溶解,无损转移到100ml容量瓶中,加5ml乙酸锌溶液及5ml亚铁氢化钾溶液,定容至刻度,摇匀。静置30min,过滤,滤液备用。②显色和比色取2支比色管,编号,按表2所示分别加入待测液和显色剂,空白调零可使用制作标准曲线的0号管。加热、定容和比色等其余操作与制作标准曲线相同。表2样品还原糖测定管号还原糖待测液(mL)