质粒的提取酶切实验报告.doc

实验一质粒的提取酶切实验目的掌握质粒小量快速提取法。用琼脂糖凝胶电泳法鉴定其纯度。实验原理质粒是一种染色体外的稳定遗传因子。大小在1~200kb之间,具有双链闭合环状结构的DNA分子。主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中。质粒具有自主复制和转录能力,能使子代细胞保持它们恒定的拷贝数,可表达它携带的遗传信息。他可独立游离在细胞质内,也可整合到细菌染色体中,它离开宿主的细胞就不能存活,而它控制的许多生物学功能却赋予宿主细胞的某些表型。采用溶菌酶可破坏菌体细胞壁,十二烷基磺酸钠(SDS)可使细胞壁裂解,经溶菌酶和阴离子去污剂(SDS)处理后,细菌DNA缠绕附着在细胞壁碎片上,离心时易被沉淀出来,而质粒DNA则留在上清液中。用酒精沉淀洗涤,可得到质粒DNA。在细胞内,cDNA)常以超螺旋形式存在。若两条链中有一条链发生一处或多处断裂,分子就能旋转而消除链的张力,这种松弛型的分子叫作开环DNA(ocDNA)。在电泳时,DNA形式存在,它比其开环和线状DNA的泳动速度都快,因此在本实验中,质粒DNA在电泳凝胶中呈现3条区带。限制性内切酶是一种工具酶,这类酶的特点是具有能够识别双链DNA分子上的特异核苷酸顺序的能力,能在这个特异性核苷酸序列内,切断DNA的双链,形成一定长度和顺序DN***段。EcoRI和BglII的识别序列和切口是:EcoRI:G↓AATTCBglII:A↓GATCTG,A等核苷酸表示酶的识别序列,箭头表示酶切口。限制性内切酶对环状质粒DNA有多少切口,就能产生多少酶切片段,因此鉴定酶切后的片段在电泳凝胶的区带数,就可以推断酶切口的数目,从片段的迁移率可以大致判断酶切片段大小的差别。用已知分子量的线状DNA为对照,通过电泳迁移率的比较,就可以粗略推测分子形状相同的未知DNA的分子量。实验步骤(一)质粒的提取培养细菌将带有质粒DH5ɑ的大肠杆菌接种于5ml含100μg/ml氨苄青霉素的1×LB中,37℃培养过夜。,10000r/min离心lmin,去掉上清液。加入150μl溶液I,充分混匀,在室温下放置10min。加入200μl新配制的溶液II,加盖后温和颠倒5~10次,使之混匀,冰上放置2min。加入150μl冰冷的溶液III,加盖后温和颠倒5~10次,使之混匀,冰上放置10m