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β细胞素对胰腺干细胞转分化为胰岛样细胞团的影响
(作者:___________单位: ___________邮编: ___________)
【摘要】目的: 探讨大鼠β细胞素在胰腺干细胞的增殖和转分化为胰岛细胞中的生物学作用。方法: 分离并培养大鼠胰腺干细胞于CMRL1066和无血清DMEM/F12培养液中, 不同浓度大鼠β细胞素处理后, 双硫腙染色,
放免法检测胰岛素分泌量。结果: 在大鼠β细胞素浓度为20~30 mg/L时, 大鼠胰腺干细胞转分化为胰岛样细胞团的数量明显高于对照组; 其胰岛素分泌量明显高于对照组()。结论: 大鼠β细胞素具有促进胰腺干细胞转分化为胰岛β细胞并增强其胰岛素分泌的作用。
【关键词】β细胞素; 糖尿病胰腺干细胞
胰岛移植是治疗糖尿病的一个热点, 但供体的缺乏和存在免疫排斥反应限制了其应用。胰腺干细胞能定向分化成胰岛细胞, 这为胰岛移植提供了新的材料来源[1]。细胞生长因子在干细胞的发育和分化中发挥了重要作用。研究表明, β细胞素(betacellulin, BTC)属于表皮细
胞生长因子家族中的一个成员, 具有多种生物学功能, 胰腺BTC mRNA的高水平表达, 提示BTC可能在胰腺组织的发育中发挥重要的生理作用[2, 3]。本研究中通过建立稳定的胰腺干细胞体外培养方法, 将
β细胞素用于胰腺干细胞的体外培养, 观察其是否能促进胰腺干细胞转分化为成熟的胰岛, 为克服胰岛移植时的供体短缺提供新的胰岛来源。
1 材料和方法
材料
SD大鼠(体质量250 g, 雌雄不限, 饲养于清洁级动物房自由饮水和进食, 手术前1 d禁饮食)由第四军医大学动物中心提供, Ⅴ型胶原酶、 Histopaque( kg/L)、Histopaque()(kg/L)、 Histopaque( kg/L)、碱性成纤维细胞生长因子2(basic fibroblast growth factor 2, bFGF2)、角朊细胞生长因子(keratinocyte growth factor, KGF)、 ITS(insulintransferin selenium)购自Sigma公司; 牛血清白蛋白(BSA) 购自杭州四季青生物制品公司; 双硫腙(dithizone, DTZ)、二***亚砜(DMSO)、烟碱购
于华美公司; 兔抗小鼠的PDX1和CK19抗体购自北京中山生物工程有限公司; 免疫组化SP检测试剂盒购自福州迈新生物技术开发有限公司; CMRL1066、 DMEM/F12 购于Gibco公司; 胰岛素放射免疫分析试剂盒购于北京北方生物技术研究所; 大鼠β细胞素由本研究室采用基因工程方法获得[4]。
方法
大鼠胰腺干细胞的分离、培养
采用宋振顺等[5]的方法, 首先以
Ⅴ型胶原酶消化成年SD大鼠胰腺组织, 然后采用非连续密度梯度离
心法纯化消化后的胰腺细胞, 去除胰岛细胞后, 收集外分泌部细胞进行培养。所获的细胞培养在含100 mL/L胎牛血清的CMRL1066培养液中, 其中添加100 U/mL青霉素、 100 g/L链霉素、 500 μg/L二性霉素B。第3天将培养液改为DMEM/F12, 其中加入ITS(5 mU/L