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qPCR操作步骤————————————————————————————————作者:————————————————————————————————日期: QPCR(Real-timeQuantitativePCRDetectingSystem)即实时荧光定量核酸扩增检测系统,也叫实时定量基因扩增荧光检测系统。标准的两步法:RNA提取→随机引物反转录→反转录产物10倍稀释→real-:1高质量的RNA获取,这里的高质量不是强调RNA降解,而是强调RNA的纯度,不能含有基因组DNA,以及其他杂质污染。基因组DNA的存在会导致定量偏高,给你错误的结果,所以一般用于定量PCR的RNA必须使用DNase处理,消除DNA污染。而RNA中的杂质的污染会限制real-timePCR的反应,导致扩增失败,给你假阴性的结果。RNA的降解不是关键,一个是因为定量PCR的引物扩增目的长度本身很短,150-250个bp,并不用于扩增目标基因的全长。此外是因为存在内参基因,所以RNA降解会通过内参基因的测定来平衡。毕竟一旦发生降解,所有的RNA以同样的速度降解,而相对比率不会改变。2减少加样误差,在使用SYBRGreenMIX的时候,一定要先按照反应的量(比如8个孔)把所有的试剂一次性配成MIX然后分装,留出5微升的反应体系给模板,使用5微升是因为只有5微升以上,加样枪的误差才会比较小,如果你仅仅是吸取一微升的话,手重一点或者轻一点都会造成极大的加样误差,严重影响你的定量精确度。3选择合适的内参基因,一般用于定量PCR的内参基因有好几种,但却没有完全通用的内参基因。具体到不同来源的细胞,比如不同组织来源,或者是动物等等,内参基因会有差异,最好的办法是,在你的样品上先测试内参基因,找到变化最小,最稳定的一个。4合适的引物设计,避免出现引物二聚体,非特异性扩增等。Q-PCR实验流程:①实验前准备,每天早上到实验室后,先把超净工作台的紫外灯打开15-20分钟。②超净台前做实验,需佩戴干净的橡胶手套/一次性薄膜手套,RNA抽提需带口罩。③取EP管/枪头时需用镊子,不可以用使用过的手套直接取用。取完EP管/枪头后,袋子及时封好。④橡胶手套须放入超净台照射紫外,实验操作过程中不得带出超净台,移液器在一天工作结束后调至最大量程,并用75%乙醇清洁移液器,枪头盒及超净台面。⑤实验进行的过程中或观看实验时,没有带口罩不要在超净台前讲话。二、总RNA抽提1)细胞样品用1*PBS洗2次后,用1ml枪将PBS吸干净,加入1mlTrizol(invitrogen)溶液,吹打混匀,,室温静置5min;组织样品用液氮充分研磨,加入1mlTrizol溶液,混匀,室温放置5min使其充分裂解;(管盖与管壁都需标记样品名称);加入200μl***仿,剧烈振荡混匀30s,使水相和有机相充分接触,室温静置3-5min;3)4℃下,14,000g离心15min,可见分为三层,RNA在上层水相,移至另一个新的RNasefreeEP管;(用20-200ul的枪吸取上清,吸上清时,枪头应沿着液面上层吸取上清,枪头不可碰到、吸到中间层)4)沉淀RNA:加入等体积异丙醇,轻柔地充分混匀(颠倒6-8次)(不应用振荡器混匀),室温静置10min;5)4℃下,