qPCR操作步骤.doc

具体的操作步骤是,RNA提取,随机引物反转录,反转录产物10倍稀释,real-time 。一步法是把反转录和扩增联合起来做,不推荐使用。
具体的注意事项有
1:高质量的RNA获取,这里的高质量不是强调RNA降解,而是强调RNA的纯度,不能含有基因组DNA,以及其他杂质污染。基因组DNA的存在会导致定量偏高,给你错误的结果,所以一般用于定量PCR的RNA必须使用DNase处理,消除DNA污染。而RNA中的杂质的污染会限制real-time PCR的反应,导致扩增失败,给你假阴性的结果。RNA的降解不是关键,一个是因为定量PCR的引物扩增目的长度本身很短,150-250个bp,并不用于扩增目标基因的全长。此外是因为存在内参基因,所以RNA降解会通过内参基因的测定来平衡。毕竟一旦发生降解,所有的RNA以同样的速度降解,而相对比率不会改变。
2:减少加样误差, 在使用SYBR Green MIX的时候,一定要先按照反应的量(比如8个孔)把所有的试剂一次性配成MIX然后分装,留出5微升的反应体系给模板,为什么要使用5微升,是因为只有5微升以上,加样枪的误差才会比较小,如果你仅仅是吸取一微升的话,手重一点或者轻一点都会造成极大的加样误差,严重影响你的定量精确度。
3。选择合适的内参基因,一般用于定量PCR的内参基因有好几种,但却没有完全通用的内参基因。具体到不同来源的细胞,比如不同组织来源,或者是动物等等,内参基因会有差异,最好的办法是,在你的样品上先测试内参基因,找到变化最小,最稳定的一个。
4。合适的引物设计,避免出现引物二聚体,非特异性扩增等等
Q-PCR实验流程
一、①实验前准备,每天早上到实验室后,先把超净工作台的紫外灯打开15-20分钟。②超净台前做实验,需佩戴干净的橡胶手套/一次性薄膜手套,RNA抽提需带口罩。③取EP管/枪头时需用镊子,不可以用使用过的手套直接取用。取完EP管/枪头后,袋子及时封好。④橡胶手套须放入超净台照射紫外,实验操作过程中不得带出超净台,移液器在一天工作结束后调至最大量程,并用75%乙醇清洁移液器,枪头盒及超净台面。⑤实验进行的过程中或观看实验时,没有带口罩不要在超净台前讲话。
二、总RNA抽提
1)细胞培养皿中细胞样品用1*PBS洗两次后,用1ml枪将PBS吸干净,加入1ml Trizol (invitrogen)溶液,吹打混匀, RNase free EP管中使细胞充分裂解,室温静置5min;
组织样品用液氮充分研磨,加入1ml Trizol (Invitrogen)溶液,混匀,室温放置5min使其充分裂解;(管盖与管壁都需标记样品名称)
2)加入200μl***仿,剧烈振荡混匀30s,使水相和有机相充分接触,室温静置3-5min;(离心时离心管按顺序排放,离心完毕,离心管的顺序也按顺序排好,与第一步的顺序一致)
3) 4℃下,14,000g离心15min,可见分为三层,RNA在上层水相,移至另一个新的RNase free EP管;(用20-200ul的枪吸取上清,吸上清时,枪头应沿着液面上层吸取上清,枪头不可碰到、吸到中间层)
4)沉淀RNA:加入等体积异丙醇,轻柔地充分混匀(颠倒6-8次)(不应用振荡器混匀),室温静置10min;
5)4℃下,14,0