实验三+3,5-二硝基水杨酸法测定还原糖.doc

实验三3,5-二硝基水杨酸法测定还原糖一、实验目的1、掌握还原糖定量测定的原理和方法。2、掌握分光光度计的使用方法。二、实验原理还原糖的测定是糖定量测定的基本方法。还原糖是指含有自由醛基或***基的糖类,单糖都是还原糖,双糖和多糖不一定是还原糖,其中乳糖10257RP麦芽糖是还原糖,蔗糖和淀粉是非还原糖。还原糖在碱性条件下加热被氧化成糖酸及其它产物,3,5-二硝基水杨酸则被还原为棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸。在一定范围内,还原糖的量与棕红色物质颜色的深浅成正比关系,利用分光光度计,在540nm波长下测定光密度值,查对标准曲线并计算,便可求出样品中还原糖和总糖的含量。由于多糖水解为单糖时,每断裂一个糖苷键需加入一分子水,。三、实验器材1、实验仪器1)恒温水浴锅2)可见光分光光度计3)电子天平4)三角瓶(100ml)5)容量瓶(100ml)6)胶头滴管7)移液管2、实验材料1)食用面粉2)1mg/ml葡萄糖标准液:准确称取100mg分析纯葡萄糖(预先在80℃烘至恒重),置于小烧杯中,用少量蒸馏水溶解后,定量转移到100ml的容量瓶中,以馏水定容至刻度,摇匀,冰箱中保存备用。3)3,5-二硝基水杨酸试剂:,5-硝基水杨酸和262ml2mol/NaOH溶液,加到500ml含有185g酒石酸钾钠的热水溶液中,再加5g结晶酚和5g亚硫酸钠,搅拌溶解。冷却后加蒸馏水定容至1000ml,贮于棕色瓶中备用。4)碘-碘化钾溶液:称取5g碘和10g碘化钾,溶于100ml蒸馏水中。5)酚酞指示剂:,溶于250ml70%乙醇中。6)6mol/LHCl。7)6mol/LNaOH。四、实验步骤(一)制作葡萄糖标准曲线取7支试管编号,按表1分别加入浓度为1mg/mL的葡萄糖标准液、蒸馏水和3,5-二硝基水杨酸(DNS)试剂,配成不同葡萄糖含量的反应液。表1葡萄糖标准曲线制作管号1mg/mL葡萄糖标准液(mL)蒸馏水(mL)DNS(mL)葡萄糖含量(mg)光密度值(OD540nm)         将各管摇匀,在沸水浴中准确加热5min,取出,冰浴冷却至室温,用蒸馏水定容至25mL,在分光光度计上进行比色。调波长540nm,用0号管调零点,测出1~6号管的光密度值。以光密度值为纵坐标,葡萄糖含量(mg)为横坐标,做出标准曲线。(二)样品中还原糖和总糖含量的测定1、样品中还原糖的提取:准确称取2g食用面粉,放在100ml三角